DOC《南京林业大学》

6 1.3.2 荧光原位杂交技术基本原理

6 1.3.3 荧光原住杂交技术中的探针

6 1.3.4 荧光原位杂交技术的应用

8 2 亚洲百合'

Ceb Dazzle'

45s rDNA荧光原位杂交

10 2.1 试剂与配方

10 2.2 实验材料

10 2.3 实验方法

10 2.3.1 探针DNA制备

10 2.3.1.1感受态制备

10 2.3.1.2质粒转化

11 2.3.1.3 减法少量提取质粒DNA

11 2.3.2荧光原位杂交(FISH)流程

12 2.3.2.1探针标记

12 2.3.2.2染色体制片

12 2.3.2.3染色体制片的预处理

12 2.3.2.4原位杂交

13 2.3.2.5杂交后漂洗

13 2.3.2.6 套染与封片

13 2.3.2.7照相及图像处理

14 2.4 实验结果

14 2.5讨论

15 致谢16 参考文献:

17 1文献述综 1.1百合的概况 百合(Lilium spp)是单子叶植物亚纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)所有种类的总称,主要分布在北半球的温带和寒带地区,少数分布在热带高海拔地区.中国是百合属植物的自然分布中心,也是世界百合起源中心之一[1].全世界的百合属植物约有94个种,起源于我国的有47个种、18个变种,占世界百合属植物的一半,其中36个种、15个变种为我国特有种.按英国皇家园艺学会(Royal Horticultural Society)对百合栽培品种的分类方法,现在流行的亚洲百合杂种系、东方百合杂种系、麝香百合杂种系、喇叭型百合杂种系培育过程中均利用率我国的原产百合种质资源. 百合属植物的种间杂交早在20世纪20~30年代国外就有研究.20世纪80年代以来,我国亦开始了百合的种间杂交育种工作,并利用丰富的野生资源,进行远缘杂交获得了百合种间杂种. 百合是百合科(Liliaceae) 多年生鳞茎植物.通常所说的百合是指百合属( Lilium) 植物各种及品种的总称.百合花朵硕大、花色艳丽、花姿百态、芳香怡人,栽培及应用历史悠久.目前,百合已成为世界五大鲜切花之一, 在世界鲜切花市场占有十分重要的地位.百合种质资源收集、评价和利用及其种质创新历来为国内外所重视.近20多年来, 百合育种发展较快,以荷兰和美国为中心,每年推陈出新,育出数以千计的百合品种,几乎垄断了国际百合种球市场.因此,百合新品种培育已成为国际鲜切花市场商业竞争的核心.百合属植物种类全世界约有100种, 中国原产约55种, 也是百合属植物自然分布中心之一.我国有着丰富的百合资源, 自20世纪80年代始, 我国就开始观赏百合的研究, 在资源引种驯化、形态与细胞遗传学背景研究、远缘杂交育种等方面取得较多成就, 但鲜见具有较高观赏价值的商业品种问世.而荷兰等花卉育种技术先进的国家, 以远缘杂交为核心育出众多新优品种.百合种质创新已成为我国切花市场核心竞争力的瓶颈.上海市等主要鲜切花消费城市把发展百合花卉产业、开展种质创新放在重要地位. 1.2百合的细胞遗传学研究进展 1.2.1百合的核型研究进展 百合依其生物学特性分为7组,即:Lilium,Martagon,Pseudolirium,Arehelirion, Sinomartagon,Leucolirion和Oxypetala(Comber,1949).一般情况下,百合组内的种间杂交较易成功且杂种可育,而组间的杂交较困难且杂种高度不育.铁炮百合、亚洲百合和东方百合三大品种群就分别源于Leucolirion,Sinomartagon和Archelirion的组内种间杂交.尽管组间杂交难度较大,但更具有较好的商业前景,而且荷兰育种公司已从这种组间杂交的回交一代中选育出商业价值较高的三倍体品种,这表明组间杂交获得的二倍体F1代中产生了没有减数的体细胞配子,同时也意味着组间的基因组差异较大而造成近缘染色体在减数分裂中期I不能正常联会(Zhoueta1.,2008).因此,分析百合属植物之间的基因组差异对百合育种工作可能会有一定的指导意义[2-3]. 自20世纪80年代以来,对百合属植物的细胞学研究陆续开展,研究了野百合( L.brownii)等14种百合的核型.据报道,百合属植物的染色体数目除卷丹为三倍体(2n = 3x = 36)外,其余多为二倍体(2n = 2x = 24),少有不同.百合属植物的染色体为大型染色体,长度变异于15~30μm,且由两对具中部(m)或近中部(sm)着丝点的大型染色体以及10对近端部(st)和端部(t)着丝点染色体所组成.种间的差异主要是各不同类型染色体的数量及其在核型中排序的位置差异,以及随体的数目和位置的不同.百合属核型中,第1和2号染色体短臂紧靠着丝粒处均有一次缢痕,但有的种次缢痕大而明显,有的种不甚明显.众多研究表明,百合的天然种群中都存在着或大或小的染色体变异,这些变异在进化中起着十分重要的作用[4-5]. 目前,国内外已经进行了大量的相关方面的研究, 如利用核型分析技术描绘了日本产的19 种百合的染色体核型, 并探索了百合的起源与进化、鉴定了10种狗尾草属野生近缘种的染色体、分析了两个茄子品种核型、研究了芙蓉葵有丝分裂核型分析及减数分裂等.国外对野生百合资源的研究较早, 英国在16世纪末期就开始了野生百合的调查、收集和评价.近年来我国也开展了对部分百合属植物资源的研究, 如对毛百合( L.dauricum K er.gew l) 、卷丹( L.lancifolium Thunb. ) 、细叶百合( L.pum ilum DC. ) 、条叶百合( L.callosum S ieb. et Zucc. ) 、垂花百合( L.cernuum Kom.ar. )、泸定百合( L.sarg entliae W ilson. )、紫斑百合( L.nepalense D. Don. ) 、淡黄花百合( L.sulphureum Baker) 、轮叶百合( L.distichumN akai et K am ibayash.i ) 、朝鲜百合( L.amabile Palib. ) 等进行了核型研究.对部分种类还进行了种内的居群核型研究, 如淡黄花百合、紫斑百合、渥丹百合( L.concolor Salisb. )、岷江百合( L.regaleW ilson) , 但相对于中国丰富的野生百合资源, 这些种的染色体资料还不够,对于有些种类如毛百合、川百合等前人的研究结果也不尽相同[6]. 1.2.2百合的Giemsa C-分带研究进展 染色体分带(chromosome banding)是20世纪60年代后期发展起来的一项细胞学技术,它是借助于某些特殊的染色程序使染色在一定部位内显现出深浅不一带纹的细胞学技术.由于特定染色体有其特定的带纹,因此,分带技术可作为鉴别染色体组和单个染色体的手段,从而可以深入地认识染色体结构成分遗传的关系[7].自1972年Vsa将Giemsa分带技术引入到植物中以来,现已发展有G-带N-带和C-带技术.其中应用最为广泛的是C-分带技术.这不仅表现在C-带程序有较高的灵敏性,使C-分带技术有可能检测到染色体上全部的着丝粒带和大部分的臂间中间带[8-9],根据这些带型特征可以识别特定的染色体和研究物种的进化及不同基因组之间的关系,而且还表现在已进行过C-带研究的植物种类最多,种改进的C-带流程也最多,积累了比较丰富的经验[10].同时也提出了许多试图解释C-带显带机制的假说.本文拟通过对这些假说的简要介绍,对其显带机制作进一步的探讨.并对利用C-分带技术进行染色体显带时需要注意的问题进行了分析. 1.2.3百合的荧光原位杂交研究进展 由于百合生长缓慢,幼苗和成苗之间差异很大,从幼苗到开花通常需要2-3年时间,通过形态特征进行早期鉴定效果有限.近年来对百合杂种鉴定的报道表明荧光原位杂交技术(FISH)可以为百合的杂种鉴定提供一种快速的手段[11].45S rDNA是编码组成真核生物细胞质核糖体的18S、5S和28S rRNA的基因.在植物基因组中通常有几百个45S rDNA以串联的方式分布于核仁组织区,而且在不同物种中其数量和位置不同,这为研究同属植物的核型差异提供了一条很好的途径. 基因组原位杂交(GISH)是以亲本之一的总基因组DNA做探针,另一亲本的基因组DNA做封阻,在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种染色体/染色质检测技术.在其发展的十几年里,已在植物的基因组研究中发挥了重要的作用.应用这一技术可对多倍体中基因组之间的亲缘关系、基因组组成及起源进行研究;