PDF《驯化硝化型生物絮体养殖南美白对虾的初步研究》

7 ] 总结的碳 源添加量计算公式并结合水质情况调整( 表1).当投糖量较多时, 投糖前补充纯氧.当pH低于

7 . 8时, 补充 N a H C O

3 , 慢慢调节 p H至8.0.每

3 天补充一次微量元素.整个养殖期间不换水也 不去除部分 T S S , 每隔两周添加一次自来水, 补充 蒸发掉的水分.

1 .

4 样品的采集与测定

1 .

4 .

1 水样的采集和水质指标的测定 每天上午

7 :

0 0用WT W 便携式多参数水质 分析仪 ( M u l t i

3 4

3 0 , 德国) 测池水pH、溶解氧(DO)、温度 ( T ) 、 盐度 ( S a l i n i t y ) .每 5天上午

8 :

0 0 取水样, 经0.45μ m滤膜过滤后测定总氨氮 ( T A N ) , 亚硝酸盐氮( N O

2 - N ) 、 硝酸盐氮( N O

3 - N ) 、 正磷酸盐( P O

4 3 - P) 和碱度( A l k a l i n i t y ) .每 5天 测量一次总悬浮颗粒物(TotalS u s p e n d e d S o l i d s , T S S )和絮体体积(FlocV o l u m e , F V) . T A N含量的测定采用水杨酸 次氯酸盐光度法 (

7 5

2 S 紫外可见分光光度计, 上海棱光技术有限 公司生产, 下同) , N O

2 - N含量的测定采用 N (

1 萘基) 乙二胺分光光度法, N O

3 - N含量的测定 采用紫外分光光度法, P O

4 3 - P含量的测定采用 钼锑抗光度法, 碱度的测定采用酸碱指示剂滴定 法, T S S 含量的测定采用称重法[

1 0 ] .F V的测定 参考 A V N I M E L E M C H 和KOCHBA[11]使用的方法, 用英霍夫管取

10 0 0m L水样, 静置

3 0m i n 后, 悬浮物的沉积量即为 F V .

1 .

4 .

2 生物絮体细菌样品的采集与测序 生物絮体菌样的采集 根据实验的进程每 池每次随机取

5 0m L养殖水, 保存于 -

8 0℃冰箱 中.实验结束后送样至上海欧易生物医学科技 有限公司进行高通量测序. 生物絮体的细菌 D N A提取和 P C R扩增 使用E.Z.N.A.LsoilD N A K i t( O m e g aB i o t e k , N o r c r o s s ,G A ,U . S . ) 提取生物絮体的细菌 D N A , 使用

1 6 Sr D N A 的V3V4区 特异引物343F和

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8 R进行 P C R扩增.每个样本重复 3次. I l l u m i n a M i S e q 测序 扩增产物用

2 %琼脂糖 凝胶 电泳测定, 回收目标条带.使用AxyPrepDNAGelE x t r a c t i o n K i t( A x y g e n B i o s c i e n c e s , U n i o n C i t y , C A , U .S . )进行纯化并使用QuantiFluorTMST( P r o m e g a ,U . S . ) 进行定量, 纯化的产物进行相应比例的混合后在IlluminaMiSeq平台进 行equimolarand双 末端测序. 测序数据处理由 I l l u m i n aM i s e q测序所得数 据进行去杂并拼接, 使用 T r i m m o m a t i c软件对原 始双端序列进行去杂.去杂后的双端数据使用 F L A S H软件进行拼接.拼接后的原始数据接着 进行精准去杂, 去除低质量的碱基序列以及模糊 碱基序列.随后对去杂后的数据采用 u s e a r c h去 除嵌合体序列, 最终得到较优质的序列, 进行下 游分析. O T U聚类和物种注释 首先进行挑选 O T U 步骤, 即对所有的优质序列使用 C D H I T方法以

9 7 %相似度进行 O T U分类,

9 7 %相似度即对应物 种分类到属的一个水平分类标准.随后统计各 个样品包含的 O T U种类以及每个 O T U中含有的 序列的比例.并且对每个 O T U挑选出代表序列, 同时, 将所有代表序列与 G r e e n g e n e s 数据库比 对, 通过 R D P c l a s s i f i e r N a i v eB a y e s i a n分类算法对 代表序列进行分类注释.分别在门( p h y l u m ) 、 纲(class)和属( g e n u s ) 的分类水平上统计样本的群 落丰度和组成.