PDF《在大肠杆菌中分别表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1和G2》

低融点琼脂糖 、 I P TG、 X―g 为Fhtka公 司产品 ;

硝酸 耋f维索 膜为浙江 黄岩化 工 厂产 品. .

2 方法2.1扩增 基因 分别扩 增76―1

1 8株和 A 9株病毒 G l和76―1 l 8株G2编码 区基因.

2 1 .

1 引物 由北 京中 国科学院 微生物研 究所 合成 . Gl引物 : +5 一C C G A AT TC AT G GG GA T A T GG A AG T G一3 (

4 1 ~5

7 ) E e o R[

5 '

_ c ( 礁鱼 : 旦ABa mHI 一3c1969~1984)正链引物从 汉滩 病毒 Gl 的第 一个起始密码 ( A T G) 开始, 负链 引物到 M 片段基 因的

1 9

8 4位 校昔 酸. 并在 其 后加上 了终止密 码TA G;

~ 负链之 间包含 了Gl编码 区基因和 G l与G2之间的分 子量 约为 6k D的多肚;

为 了方 便克隆 . 在正 、 负链 弓I物上分别加上 了EcoRI和BamHl 酶切 位点(Gl 编码区基 因中无 此二种 酶切 位点) 及两个保护性碱 基G2引物 : +5 _G GA A T TC A TC - T C A G AG A C A C C A T TA A C T C C一3 (

1 9

8 5 ~2

0 0

7 ) . E∞Rl 一5~C C G GA T C C T A G TA G T AG A C A C C G(

3 ~2 - -3

6 1

6 ) Ba r nH【 正链引物从 M 片段 的1985位 核昔 酸开始, 在其之前加上了 一个起 始密码 A T G, 负链 引物到 M 片段的结 尾;

正负链 引物之 间包 含有 G 2的编 码区和 M 片段 基因 e DN A的3末端 非编码 区基因 ;

与G1的引物一样 . 分 别在 正负链弓 I 物 上加 上1和Bm'

nHI 酶蜘位 点( G2编码区基因中设 有这 两种 酶切位 点) .

2 .

1 . 2. P C R扩增 反应 Gl 和G2编码 区基因的 P C R扩增 按常规方法进行 . 模 板为 质粒 M5

6 ;

取PCR反应 产 物进 行琼脂糖 凝胶 电泳. 以检测 P C R产物 的大 小及纯度.

2 .

1 .

3 P C R产 物回收 用低融 点琼脂糖方法 回收 P C R产物, 方法详 见 参考 文献口 】 .回收 后的 P C R产物取 一 部分进行琼 脂糖 凝胶 电泳, 估计 回收产物 的量 .

2 .

2 P C R 产物克隆 利用 T载体克隆 P C R产物 , T载体的制备按参考文献 …进行 , 连接 反应 及质粒 的转 化按常规方 法进行 , 梅建过 程 见图

1 , G 1和G2的 P C R产物的 克隆 质粒分别命名 为pAT76GI和pAT76G2 .

2 .

3 克隆 筛选和 鉴定

2 .

3 1 观 察质粒大 小进 行初步筛选 .

2 .

3 2 初步 鉴定 分别用 G l和G2区的 弓I物从初步 筛选 的G1和 G 2克隆质粒扩 增Gl和 G 2特异性核馥 片段,对筛 选的 质粒 进行 初步鉴 定. G1 l 物86(+)

5 . _A TA C C C A A . GT AA G T TG GA GA G G一3 (

2 6

9 ~2

9 0 ) B

5 ( 一)

5 一A AT AT C A A A G AT C C C A TG一3 (

6 3

1 ~6

4 8 ) G 2引物 MI ( +)

5 一G A T AG G A A TG A T T GrnTG T一3 (

2 4

9 5 ~2

5 1

4 ) ;

_ 嚣:...一――――― 广― _ 『 _ ――― 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 黄 长形 等: 在大肠杆 菌中分别 表达汉糟病毒囊膜糖 蛋白Gl 和G2315CCATCAGGGTC TT TCC A 一3 P C R方 法同前 .P C R产物 电诛后 观察有无 目的棱酸产 物带 物的大小 为367bp(2877~2

8 6

1 ) G l的扩 增产物 大小 为377hp,G2的扩 增产

2 .

3 .

3 酶切鉴 定Gl所用的 内切酶有 E c o RI , B a mHI , H i n d I l

1 . P v u I I 和隧lIl;

G2所 用的 内切 酶包括 E c o R I , B a mHl , H i n c l I B s t EU. 酶 切接常规方法 进行 .

2 4 掏建 GI和G2的表达 质粒 用EcoRI 和BamHI 从上述 P c R产物克 隆的 阳性 质粒中切下 Gl 和G2编 码基因 , 并用低融点琼脂糖方法 加 以回收 , 同样 用EcoRI和BamHI 切害 I 表达载 体 质粒 p B V