编辑: 丶蓶一 2019-07-04

5、本试剂盒的裂解液可以和本公司生产的其它Caspase活性检测试剂盒的裂解液通用,即本试剂 盒裂解液制备的蛋白样品可以用于本公司其它Caspase活性检测试剂盒的检测.

6、细胞数量需达到3~5*10

6 个或新鲜组织100mg,以便能达到测定需要的100~200μg蛋白的要 求,因为Caspase-3的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关,如测定的OD值偏低,可通过增加细 胞数量或组织量的方法来提高蛋白量.

7、样品中激活的caspase水平很低.首先确认凋亡现象是否明显,如果凋亡比较明显并且确认该 caspase是可以被激活的,可以适当调节诱导细胞凋亡的时间,希望能找到一个caspase激活 比较强的时间点,这样就可以检测出该caspase的激活.可以作一时间曲线,例如诱导凋亡

0、

2、

4、

8、16和24小时,或

0、

1、

2、

4、8和16小时,或

0、

1、

2、

4、6和8小时等.具体的诱 导凋亡时间需根据具体情况而定.

8、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作.

六、操作规程

1、准备工作: a、裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用. b、裂解液工作液的准备:使用前每50μl 裂解液加入0.5μl DTT c、2*反应液溶解后混匀并置于冰浴上备用

2、样品的处理: a、对于悬浮细胞: 把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品,离心(2000rpm,5min)收集细胞,小 心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次.同前吸尽上清后,按照每200 万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液, 重悬沉淀, 冰浴裂解30min, 其间涡旋振荡3~ 4次,每次10s;

或冻融2~3次.下转第3步进行实验. b、对于贴壁细胞: 按常规的方法用胰酶消化贴壁细胞,并收集细胞.用PBS洗涤一次,吸尽上清后,按照 每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解30min,其间涡旋 南京建成生物工程研究所(本试剂盒仅用于科研) www.njjcbio.com 公司地址:南京市玄武区中央路 258-27 号新立基大厦 邮政编码:210009 E-Mail:[email protected] 联系

电话:025-

83360321、

83360969、83551389 技术支持:025-83360272 传真号码:025-83227943 振荡3~4次,每次10 s;

或冻融2~3次.下转第3步进行实验. c、对于组织样品 每50mg固体组织置于培养皿中,手术剪剪碎成3mm*3mm左右的小块,加入50μl 冰冷 裂解液工作液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆.然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中,冰浴再 裂解5分钟.下转第3步进行实验.

3、4℃ 离心(12,000rpm, 10~15min).

4、小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中,并放置冰上待用.

5、立即测定caspase 3的酶活性或-70℃保存样品,同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓 度.如果细胞较小,可以适当增加细胞的用量.

6、Caspase 3酶活性的检测: a、取出适量的Ac-DEVD-pNA 和2*反应液,置于冰浴上备用. b、使用前每50μl 2*反应液加入0.5μl DTT. c、吸取50μl含100~200μg蛋白的细胞或组织裂解上清;

如体积不足50μL用裂解液补足至总 体积50μl(各组均采用同样的蛋白量进行测定和比较). d、如下设置反应体系: 空白对照 样品 2*反应液 50μl 50μl 裂解液 50μl 0μl 待测样品 0μl 50μl Ac-DEVD-pNA 5μl 5μl 总体积 105μl 105μl e、加入Ac-DEVD-pNA 后混匀,注意避免在混匀时产生气泡.37℃孵育4hr.发现颜色变化比较 明显时即可测定A405.如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜. f、用酶标仪或分光光度计(100μl的比色皿)在λ=405nm或400nm测定其吸光值. g、通过计算OD诱导剂/OD阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-3活化程度.

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