PPT《环境微生物学实验》

4、鞭毛染色:(1) 在牛内膏蛋白胨斜面上培养19―24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp),此培养体在取用前经过每日移植―代,连续移植5~7代.(2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B.(3)无菌水、无菌空试管、凹玻片.盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶.(4)显微镜.

5、芽孢染色:(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养24~36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌.(2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子.(3)显微镜. (4)香柏油、二甲苯、擦镜纸.(5)孔雀绿染色液、蕃红染色液.

三、操作步骤

一、单染色法 (1)涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水(图4-10a),用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀,涂成薄膜,涂布面积约1~1.5cm2(图4-10b). (2)干燥 将涂片于室温中自然干燥. (3)固定 手执载片―端,使涂菌的一面向上,将载片通过微火2~3次.在火上固定时,用手摸涂片反面,以不烫手为宜.不能将载片在火上烤,否则细菌形态毁坏(图4―10c). (4)染色 将涂片置于水平位置,滴加染色液覆盖于涂菌处,染色约2min(图4―10d). (5)水洗 倾去染色液,斜置载片,用自来水的细水流由载片上端流下,不得直接冲在涂菌处,直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4―10e). (6)干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干,注意不要擦掉菌体(图4―10f). (7)待标本完全干燥后,先用低倍镜和高倍镜观察,将典型部位移至视野中央,再用油镜观察. 图4-10 单染色方法

(二) 革兰氏染色法

1、制片 (1 ) 涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环,用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜.涂菌后将接种环火焰灭菌. (2)干燥 于空气中自然干燥.亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高). (3)固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色,常用加热法,即将细菌涂片面向上,通过火焰3次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形.此制片可用于染色.

2、染色(1)初染:于制片上滴加结晶紫染液,染1min后,用水洗去剩余染料.(2)滴加卢戈氏碘液,1min后水洗:(3)滴加95%乙醇脱色,摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min).(4)复染 滴加石炭酸复红液复染1min,水洗.(5)用滤纸吸干,油镜镜检.

3、结果 革兰氏阳性菌染成篮紫色,革兰氏阴性菌染成淡红色.

4、检测未知菌 用以上方法对未知面进行革兰氏染色,并绘图、记录染 色结果. 1.石炭酸复红染色(1)取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片,自然干燥(荚膜是多糖类物质,不可用火焰烘干).(2)滴入1~2滴95%乙醇固定(不可加热固定).(3)加石炭酸复红染液染色1~2min,水洗,自然干燥.(4)在载玻片一端加一滴墨汁,另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触,在以匀速推向另一端,涂成均匀的一薄层,自然干燥.(5)干燥后用油镜观察.菌体红色,荚膜无色,背景黑色.

(三)荚膜染色法 2.背景染色(1)先加1滴墨水于洁净的玻片上,并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀.(2)放一清洁盖玻片于混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,向下轻压,吸收多余的菌液.(3)干燥后用油镜观察.背景灰色,菌体较暗.在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜. 3.李夫森氏-硼酸钠美兰染色(1)取在阿须贝氏无氮培养基上培养3天的硅酸盐细菌少许,制成干燥涂片(不要加热固定).(2)加李夫森氏染色液染色l0min,倾之染液(勿用水洗).(3)加硼酸钠美兰染色液染色5min,水洗,晾干.(4)油镜视察可见荚膜被染成红色,菌体处成蓝色.