PDF《候可挺、》

@寻一吉第l4卷第

4 期1999年 I 2月巾国病毒学VIROLoGI CA SI NI CA V0I _

1 4 No.

4 De c

1 9

99 传染 性脾 肾坏 死病 毒(ISKNV} 感染 途径、宿主范 围及对 温 度敏感性 的研究 S

9 4 -

1 曾慷何建国翁少萍黄志坚(广州中山大学 生命科 学学 院. 广州510275J候可挺、 / / 罗均任 黄伟平 陈炯. 匣{广东省南海 市水产 局, 广 东南海

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8 2

0 0 ) 摘要传染性 脾 肾坏 死病 毒(IsKNv ) 无缅 苗游 渣通 过肌肉注射 、 划痕 浸泡、腹腔注射和口服 等 四种 感染途 径,人工 感染 健康鳜 鱼(Sinipercachuatsi).四种途 径都能引起 典型的传 染性脾肾坏 死 病毒病 .通过 腹 腔注 射感 染途径 , 病 毒滤 液在25~3 4℃ 条件 下. 能 引起 健康鳜鱼发 病 .另 外,用病毒 滤渡感染尼罗非鲫(Oreochromi s n i l o t l c u s ) 、 草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、乌鳢(ot , h i o ― c e p h a l u s a r g u s ) 、 大 口黑 鲈(Pdicropterussalmo i d e s ) 和尖 吻鲈 ( L a t e s c a l ~ a r i f e r ) 五 种鱼 大 口黑 鲈能 够感染成功 . 为ISKNV 的宿主 , 而其 它鱼不 能感染 成功 , 不是ISKNV的宿 主.￡.关键词传染性脾肾坏死病毒(IsKNV),盛基途歪.遣圭芷国.韫崖丝壁丝了s.里袭面E病鳜鱼( S i n i p e r c a c h a t s i ) 是一种淡水养殖 的名贵鱼类.随着养殖规模和 养 殖密度 的增 加, 其发病率也不断上升… .近年 . 广东地区养殖鳜鱼普遍 发生 一种 以脾 肾肿大 为主要症状 的传 染性强、 死亡率高 的疾病 . 给 养殖 业造成 了很大 的危 害.吴 淑勤等 和 何建 国等 在病 鱼体 内观察到一种切面为五角形、 六角形 、 二十面体 、 直径大约 为150tam似虹彩病 毒 的病 毒粒子 . 该病毒能够引起宿 主细胞肿大 , 强 嗜碱性, 并且 引起脾脏和 肾脏 坏死. 因此 , 将 此病毒 暂命名 为传染性 脾 肾坏死病毒( I S KNV) .近十几年 . 由虹彩病 毒引起 的淡 、 海 水鱼类 的疾 病 不断增 加.已引起 人们的高度重视 . 其 中一些疾 病的病理表现 与鳜 鱼的 I S KN V 病相似 J .本研究 着重研究 I S KNV 的感 染途径 、 宿主范围和对 温度 的敏感性 .

1 材料 与方 法11实验 鱼来源 健 康鳜 鱼、乌鳢 ( Op h i o c e Ⅱ a r gu s ) 和大 口黑 鲈(Mi c r o p t e r u ~s a l mo k t e s ) 由 南海市 水产 局提供;

尼罗非鲫 ( Or e o c h r o i i t o t i c s ) 和 草鱼 ( C t e n o p h a r y a g o d o n k t e l l u s ) 由中 山大学鱼 类研 究室 提供;

尖吻 鲈(Latcatcarifer)由东 莞水 产局 提供. 所有 的实验 健康 鱼都 取 自无 I S KNV发病 史的 地区, 养殖 于本室 水泥 养殖池中. 温 度控 制在28--3 0℃.

1 .

2 病毒 滤液 的制 备 取典 型的 自然发病 鳜 鱼脾脏 和 肾脏 . 按1:1o(w/ v) 加入PBS(pH72)和青 霉素 、 链霉索分 别为1000I U/ mL 、

1 0

0 0 / mL , 冰浴中 匀浆

3 0 r ai n后,5000r/rai n , 4℃离心30mi n , 取上 清液 经0.22m广东省 自然科 学基金 资助 项目通讯作者维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第14卷 滤膜 抽滤 后,4℃ 冰箱 中保 存. 并将滤 液接 种 于胰蛋 白胨琼 脂培 养基 上, 培养 温度 为30℃ ,

4 8 h后,观察培 养 基上 无 细菌 生长 , 此病 毒滤液 用 于人工 感染 实验 .

1 3 感染 途径 实验 实验 共设五组 , 每组健 康鳜 鱼 5尾, 养 殖温 度为

3 0±0 . 5℃ , 充气养 殖 于本 室循 环 过滤 控 温水族 箱中.(

1 ) 肌 肉注射 组:注射部 位为背 鳍前 侧基部 , 注射病 毒 滤液 按 鱼体 重计 算为0.1mL/100g.(

2 ) 腹 腔注射 组:注射部 位为腹鳍 基部 , 注射剂量 同肌 肉注射 组. (

3 ) 划痕 浸泡 组:鳜量背部 去磷 , 划破 皮肤 , 面积 为1em

2 . 在 稀释

1 0

0 0倍病 毒滤 液中浸 泡2h后, 放入水族箱 中养殖 .(

4 ) 口服组 : 用 圆头 针头 直 接插 入量胃中注 射病毒滤液 , 注 射剂量 同肌 肉注射 组.(

5 ) 对 照组 : 腹 腔注射灭 菌PBS,注射剂量按 量体重 计算 为01mL /

1 0

0 g .

1 .

4 宿 主范 围 实验 实验 鱼种 类为 尼罗非 鲫、 草鱼 、 乌鳢 、 大 口黑 鲈、失嘲鲈 .每 种鱼 分 实验 组 和对 照组, 每 组健 康鱼5尾 , 实验组 感染 方法 同腹 腔注射 组, 对照 组感 染方 法 同上 述对照组. 另 以病 毒滤 液感染健康 鳜鱼作为阳性 对照 , 方法 同腹腔 注射 组. 养殖温度 为30±0 . 5℃ , 充 气养殖 于本 室循 环过滤 控温 水族 箱中.

1 .

5 噩虚 敏感 性实验 实 验分 为2

0 、

2 5 、

2 8 、

3 0 、

3 4℃组和 对照 组 .每组 健康 鳜鱼5尾 , 实验组感 染方 法同 腹 腔注 射组 . 对照 组感染 方法 同上 述对 照组 . 充气 养殖 于本 室循 环过滤 控温 水族箱 中.1.6病理观 察 和细菌 学检 查取发病 濒 死鱼 , 观察 体表症 状和 内脏 变化,无菌操 作 取脾脏 、 肾脏 和 肝脏 组织块,加少量灭 菌PISS.匀浆后 , 接种 于胰蛋 白胨琼 脂培 养 基上 .

3 0℃ 培养48h后, 观察 细菌生长 情况.并 取肾脏和 脾脏 组织 块,Bouin'

s液固定 . 常 规石蜡 切片 , 厚度

5 - -6 m, H - E染色 , 观 察组 织病 理变 化. 取发 病鱼脾 脏于2.5%戊二醛 前固 定,1%饿酸 后固定,丙酮系列脱水 后Epon812包 埋,超薄切片. 经双 重染色后于PhilipsCM1 0透射电镜 下 观察 .

2 结果2.1感染途径 病毒滤液通过 四种感 染途 径都 能够 引起 健康媛 鱼 发病并 死亡 , 死 亡率 都为100%( 见表

1 ) . 四种途径 中, 发病 鱼平均感染后死亡时间 : 肌 肉注射组为第

1 O天,划痕浸泡组 为第 l 1天, 腹腔注射组 为第

1 4天,I:l服组为第

2 2天 .濒 死鱼表 现嘴张大, 呼 吸加 快、加深,身体失 去平 衡. 鳃苍 白, 脾脏和 肾驻肿大 , 部分 鱼体表颜色变黑 .组 织切 片观察 , 脾驻和 肾脏 中都能 见到 由 病毒感染 引起 的强 嗜碱性 、 肿大 的细胞( 见图

1 ) .透射 电镜 观察 , 可 见脾脏 细胞中有大 量切 面 为五 角形和六 角形 的病毒粒子( 见图

2 ) .细菌学检 查只有划 痕浸泡组和肌 肉注射组 各有 一尾 媛鱼 的肾脏有 少量 细菌 , 其它鱼都无细菌感染 .对照组在

3 O天观察 时间内正 常. 衰1痔毒 潍液不 同途 径感荣 健康簟 鱼Ta b l e

1 M a r d f in f is h c ha l l e n ge d di f fe r e n t wa y s 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 曾慷 等:传染性 脾 肾坏死 病毒 ( I S KNV) 感 染途 径、宿主 范围及 对温 度敏 感性 的研 究355圉I发病舞 鱼脾脏 中的强 嗜碱性 . 肿 大细瞻 F i g i The b a 帅Dhilicenl a r g e d . e l k i n I S K NV- i n~ t e d m a n df in f is h 图2遗射电镜 显示发 病蠹鱼 脾脏 中的大量 病 毒粒子 Fi g.

2 TE mi c r c gr ~ n h o f I SKNV― i n j e c t e d ma n dr i n f is h s p l e e n s h o wi n g s E i v e a nd f ix - s i de d v i r u s p g r t i c l ~

2 .

2 宿主范围5种鱼腹腔注射病毒滤液后, 大 口黑 鲈对 I S KNV 敏感, 发病死 亡, 死亡 率为 i

0 0 %( 见表

2 ) .平均 死亡时间为感 染后

1 7 d .其表现的症状 与鳜鱼 的发病症状 相似.组织 切 片中. 脾脏 和肾脏中能观察到病毒引起 的强 嗜碱性 、 肿大的细 胞.电镜观察 , 脾脏细胞中存在大量同发病 鳜鱼脾脏中相同的病毒粒子 .濒死 大口黑鲈的肝脏 、 肾脏和脾脏都不能检查到细菌 , 其它实验 鱼在注射病 毒滤 液后

3 0 d的观察 时间内没 有 发病 , 无异常 表现 . 组织病 理检 测也看不到由ISKNV引起 的强 嗜碱性 、 肿大的细胞.表明ISKNV 不但 能够感 染鳜鱼 , 还 能够 感染 其 它种 类的鱼如大 口黑鲈, 而对 另一些种类的鱼不敏感.I S KNV具有一定 的宿主 范围. 阳性 对照鳜 鱼, 平均在感染 后14d发病死亡.

2 .

3 温度敏感性在

20、

25、

28、30和

3 4℃养殖温度下, 腹腔 注射 病毒滤 液的健康 鳜鱼在

2 5~3 4℃ 之间都 能够 发病 死亡, 死亡率都 为100%( 见表

3 ) .发病鱼平均 感染 后死亡时 间:25℃组 为第 l 5天,

2 8℃ 为第 9天.

3 0℃组为第 9天.

3 4℃组为第 l 1天. 因此病 毒滤 液引起健康鳜 鱼 发病 的最适 养殖温度为

2 8 ~3 0℃ .发病鱼表现的症状与前述发病鳜 鱼相 同, 组 织切 片中, 脾 脏和 肾脏都 能观察到病毒感染引起的强嗜碱性 、 肿大的细胞. 电镜观 察发病鱼脾 脏细 胞 中存 在大 量病 毒 粒子 .发 病鱼的肝 脏、 肾脏和脾脏都不能检查到细 菌.2 0℃组在

3 0 d观察 时闻 内正 常. 组织 病理切片检测不到病 毒引起的强 嗜碱性 、 肿大的细胞.对照组 在30d观察时闻 内正常 .

3 讨论 鱼类病毒病 的传播方式, 可 以分为水平感染和垂 直感染两 种方式 .水平感染 主要 是通过 两种途径发 生的.一种是食物. 即口和 消化道 ;

另一种是 通过水 传播, 鳃 和破损 的皮肤 是感染 的主要 门户[

9 ] .I S KNV滤液从四种不同的人工感 染途 径感染健康鳜鱼, 都能够 引起健康鳜鱼 发病死 亡, 表 明这 两种水平感 染 的途 径都 可能 存在.鳜鱼是 一种 肉食性鱼 类, 主要 以小鱼 为食.在广东地区鳜鱼养殖 中, 一般用草鱼 、 鲢鱼 的鱼苗和其它 小鱼作为饲料鱼, 虽然实验 表明 维普资讯 http://www.cqvip.com

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6 中国病毒学第14卷衰3病毒滤液 在不同 量度下 感染量 l一 量结 果Ta b l e

3 I SKNV c h a l l e n g i n g h e a l t h y ma n dr i nf i s h u n d e r d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s 草鱼对 I S K NV不敏感 , 但 众多其它饲料鱼 中不排除有 I S K NV的保 存宿 主, 因此 由食 物 传播 的可能性是存在的.而鳜鱼的养殖, 一般采用封 闭式 养殖方式 , 当发 病鱼存 在时 , 病鱼 排 出的 病毒粒子吸 附并感染健康鳜鱼是完全 可能 的, 而水质 的恶化更 能加剧疾病 的流行 , 很显 然, 通 过水体体表感染途径也是存在的. I S KNV 滤液对其它五种 鱼:大口黑 鲈、草鱼 、 乌鳢 、 尼罗非鲫 、 尖 吻鲈的感染 实验, 大 口黑 鲈对 I S KNV敏感 . 而其它四种鱼不敏感 .由此 可见, I S KNV具 有一定 的宿 主范 围. 它不仅 能 够感染鳜鱼 , 而且也 能够 感染其它种类 的鱼 . 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期曾慷 等:传染性 脾 肾坏死 病毒 ( [ S K NV) 感 染途径 、 宿 主范 围及 对温 度敏 感性 的研 究357病毒感 染鱼使其发病 . 与鱼生活的水体环境温度有密切的关 系. 也与病毒发育 的最适温度 有关 . .I S KNV 在不同温 度条 件下对健康鳜鱼感 染实验结 果. 表明

2 5~3 4℃ 都是 I S KNV 适合流行 的水温 , 而28--3 0℃是其最适流行 水温 , 这与 广东地 区 7月至

1 O月的气温 高、鳜鱼ISKNV病 发病率高 是一 致的.而2O℃条 件下, 鳜 鱼不发 生ISKN V 病,显然温 度是ISKNV 病暴发流行 的限制性 因子 .因此生产 中, 为了预防 I S KNV病 的暴发流行 , 应该 注意养殖 水温 的变化 , 特别 在发病温 度范围 内.而在低于发病 的水 温时 , 要注意一些细菌性病........