PDF《说明书》

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP/ALP)活性测定试剂盒 说明书 分光光度法

50 管/24 样 注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定.

测定意义: AKP/ALP 是一种含锌的糖蛋白酶,在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化 合物.AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中,以肝脏为主. 测定原理: 在碱性环境中,AKP/ALP 催化磷酸苯二钠生成游离酚;

酚与 4-氨基安替比林和铁氰化钾反 应红色亚醌衍生物,在510nm 有特征光吸收;

通过测定

510 nm 吸光度增加速率,来计算 AKP 活性. 自备仪器和用品: 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水. 试剂组成和配制: 试剂一:液体*1 瓶,4℃保存. 试剂二:液体*1 瓶,4℃避光保存. 试剂三:液体*1 瓶,4℃避光保存. 试剂四:液体*1 瓶,4℃避光保存,未变成蓝绿色之前均可使用. 标准品:液体*1 支(EP 管中),2 μ mol/mL 酚标准液,4℃保存. 粗酶液提取: 1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,4℃、8000g 离心 10min,取上清液待测. 2. 细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为500~1000:1 的比 例(建议

500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声

3 秒,间隔

7 秒,总时间 3min);

然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测. 3. 血液可直接测定,或者适当稀释后测定. 测定步骤: 1. 分光光度计预热 30min,调节波长到

510 nm,蒸馏水调零. 2. 试剂三置于 37℃水浴中预热

30 min. 3. 空白管:取EP 管,加入 20μL 蒸馏水,200μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃ 水 浴中保温 15min;

加入试剂四 600μL,混匀后于

510 nm 测定吸光度,记为 A 空白管. 4. 标准管:取EP 管,加入 20μL 标准品,200μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃ 水 浴中保温 15min;

加入试剂四 600μL,混匀后于

510 nm 测定吸光度,记为 A 标准管. 5.对照管:取EP 管,加入 20μL 上清液,200μL 蒸馏水,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃ 水浴中保温 15min;

加入试剂四 600μL,混匀后于

510 nm 测定吸光度,记为 A 测定管. 6. 测定管:取EP 管,加入 20μL 上清液,200μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃ 水 浴中保温 15min;

加入试剂四 600μL,混匀后于

510 nm 测定吸光度,记为 A 测定管. 注意:空白管和标准管只需测定一次.每个测定管设一个对照管. AKP/ALP 活性计算: 1. 血液中 AKP/ALP 活力计算 活性单位定义:37℃中每毫升血液每分钟催化产生 1μmol 酚定义为

1 个酶活单位. AKP/ALP 活力(μmol/min /mL)= [C 标准品*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)*V 反总] ÷V 样÷T=6.8*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) 2. 组织、细菌或细胞中 AKP/ALP 活性计算 (1)按照蛋白浓度计算 活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生

1 μ mol 酚定义为

1 个酶活单位. AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C 标准品*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)*V 反总]÷(Cpr*V 样)÷T=6.8*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷Cpr (2)按照样本质量计算 活性单位定义:37℃中每克组织每分钟催化产生

1 μ mol 酚定义为

1 个酶活单位. AKP/ALP(μmol/min/g 鲜重)=[C 标准品*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)*V 反总]÷(W*V 样÷V 样总)÷T=6.8*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W (3)按照细菌或细胞数量计算 活性单位定义:37℃中每

104 个细菌或细胞每分钟催化产生

1 μ mol 酚定义为

1 个酶活单位. AKP/ALP (μmol/min/104 cell)= [C 标准品*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)*V 反总]÷(细胞数量*V 样÷V 样总)÷T= 6.8*(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷细胞数量 C 标准品:2μmol/mL;

V 反总:反应体系总体积(mL),1020μL=1.02 mL;

V 样:加入反应体 系中上清液体积(mL),0.020mL;

V 样总:加入提取液体积,1mL;

T:反应时间(min),

15 min. 注意事项: 1.试剂

二、试剂三和试剂四均需避光保存. 2.试剂四变蓝绿色后不能再使用. 3.加入试剂四后必须立即混匀,否则显色不完全. 订购

电话:4008-898-798 技术支持:13818158258