PDF《在大肠杆菌中分别表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1和G2》

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0 , 用 低融 点琼脂 糖法回收 酶切后 的载体 质牡 . 将G1和G2编码 区基因分别与 酶切后的载体 质粒 相连 接,连接 产物 转化 T GI 钙北 菌, 筛 选和鉴 定过 程同步 骤3.掏 建过 程罔2.所 得G1和G2的表达质牡分别命 名为OB76GI和 p B

7 6 G

2 . GI啦G2 Co di n g I t e l m l 芏jj质粒 a A Tt

6 GI和an'

I~6 t ;

2掏建过程示意 p

1 C o n a t r u e t i m a o t d s p AT

7 6 G| a n d pA'

I '

7 6 G2 G1 * ( Co d i ~ ge a e 翻2质粒 p l ~

7 6 Gl 和pB76G2构业 l } 呈示意囝 F

2 (

1 棚mexpre*siondpB76GI a n d p B

76 G2

2 5 GI 和G2在大 腑杆菌 中表达

2 5 .

1 G I和G2的阳性 克隆 菌株接种于 A+的I.B平板 .

3 7℃培养16h.挑起单 个 菌落接种 于3mL A+L B 培养基,

3 0℃ 振摇 过夜 . 按1:25比倒转 种于25mL ( A+) L B培 养基 ,

3 0℃ 剧裂 振摇 培养, 细菌 密度 选0.8OD6.啪时转入4

2 ℃水浴插床振插培养. 诱导表达;

诱导前和诱导后

2 、

4 、

6 h 分别取

1 m l 培养的菌液, 收集细菌 后用 于SDS―P A GE 并收集诱导

6 h 的 细菌, 冻 融后超声破碎细 菌, 裂解产物用于 E I I S A检测.

2 5

2 S DS 一聚丙烯酰 胺凝胶 电泳 ( S DS ―P A GE ) 和We s t e r n ―b l o t S DS ―P A G E接 参考文献 进行 .电诛 后 用考 马 氏亮 兰R250染色 , 观察 G l和G2表达情况 .S D S―P A G E后的 G1 和G2表达产物转 印到硝 酸纤 维 素膜上 , 用20%的 小牛血清封 闭硝酸纤维 素膜 后. 用恢复期 肾综合 征出血热 患者 的血清作 一抗 , 稀释 度为

1 :

2 0

0 .

3 7℃反应2h,辣根过氧化物酶标羊 抗人 I g G抗体 作二抗 ,

3 7℃ 反应

1 h , 洗 膜后 用DA B显色. 观 察硝 酸纤维素膜上有无特 异性 显色带

2 .

5 3 用间接 E¨ S A方法检测 G l和G2的表达 细菌裂解液经

1 2

0 0

0 r / r ai n4℃离心10mi n收集上清, 沉 淀用 8t o o l / I 尿素37℃ 浸泡

1 h , 用细 菌裂解上清和沉淀尿素 幔泡 物包被 E I I S A扳(1:50,1:100),4℃过夜 ,

2 %的牛 血清 白蛋 白4℃ 封闭过夜 , 洗涤后加抗 G1和G2的单抗 , 4℃ 反应 过夜, 洗涤后 加酶 标抗 小鼠lgG抗 体,37℃反应30r ai n , 洗板后加 底物 显色 . 维普资讯 http://www.cqvip.com

3 1

6 中国病毒学第12卷

2 .

6 表达 的G1和G2免疫 小鼠2.6.1表达 G1 、 G 2和核蛋 白( NP ) 免疫小 鼠 免疫 方法同参考文献 [

4 3 .

2 .

6 .

2 免疫 小 鼠血 清中抗汉濉病 毒抗体的检 测 采用 间接免疫 荧光 方法, 具体 步骤 同参考 文献 .

2 .

6 .

3 用 杆状病毒 表达的汉濉病 毒G1和 G 2作抗原, 检测免疫小 鼠血清 中抗汉滩病毒 G1和G2的抗 体.以 汉滩 病毒 G 1和G2重组杆状病毒 感染的 S~f 9细胞 制备 抗原片 , 用问接荧光法 加以检测 . 结果176―1

1 8株和 A 9株G1和76―1

1 8株G2编码区基因的扩增 P C R产物经琼脂糖凝胶电泳后, 在紫外灯下可见特异性 的 目的产物, G

1 的大小在

2 .

0 k b 左右 . G2的大小在

1 .

7 k b左右, 见 电泳结果照片( 图3).2PCR产物克隆 P C R产物成功地克隆到 T一载体质粒 中.P C R产物与 载体 连接 产物 转化 细菌生长后可 见蓝 白斑 ;

挑 白斑菌落培养提质粒, 质粒 电泳后可见质粒 在凝胶上迁 移速度不一, 选取迁移速 率慢 的质粒行特异性 P C R和酶切鉴定 . 实验结果符合预期结果 .