PDF《产品说明书》

US EVERBRIGHT? INC.

技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 产品说明书产品名称:YF Dye dUTP Conjugates 货号 名称 分子量 Ex/Em (nm) YD0045-5nmole 6-YF488-P4-dUTP ~1360 490/515 YD0045-25nmole YD0047-5nmole YF488A-dUTP ~1485 490/515 YD0047-25nmole YF0046-5nmole YF555-dUTP ~1550 555/565 YF0046-25nmole YD0044-5nmole YF594-P4-dUTP ~1547 593/614 YD0044-25nmole YD0043-5nmole YF640R-P4-dUTP ~1650 642/662 YD0043-25nmole 储存条件 -20℃避光保存, 至少可以储存

6 个月以上, 可以采用 pH7.4 的10mM Tris 溶解后,分装保存,避免反复冻融. 使用方法 DNA 标记

1、试剂(自备) (1) Taq DNA 聚合酶 (2)10* Taq reaction buffer (3)25 mM MgCl2 (4)dATP, dTTP, dCTP, dGTP (单独溶液),

1 mM each (5)DNA 模板 (6)正向、反向引物,10 μM each (7)PCR 清洁试剂盒

2、PCR 反应 2.1 按照表

1 反应体系配制 PCR 反应混合液: 2.2 每个反应管加 1μL 1mM YF dye dUTP 染料;

注:阴性对照管,加1μL 1mM dTTP 代替 YF dye dUTP 2.3 按照表

2 程序运行 PCR 反应 注:1)热变性时间依据不同的 Taq 酶进行调整 2)退火温度设置:Tm - 5℃ 3)延伸时间根据扩增片段大小而定,一般 200-300 bp 片段 设为

1 min 即可 2.4 可选步骤 用PCR 清洁试剂盒去除未掺入的单核苷酸 表1PCR 反应体系 组分 体积 终浓度 10*Taq reaction buffer

2 μL 1*

25 mM MgCl2

2 μL

5 mM

1 mM dATP

2 μL

100 μM

1 mM dCTP

2 μL

100 μM

1 mM dGTP

2 μL

100 μM

1 mM dTTP

1 μL

50 μM

10 μM 正向引物

1 μL

500 nM

10 μM 反向引物

1 μL

500 nM 模板

1 ng

50 pg/uL Taq

1 U 0.05 U/μL dH2O up to

19 μL 表2PCR 反应条件 94℃,

2 min ① Hold 94℃,

30 sec

30 个循环 50-60℃,

30 sec ② 72℃,

1 min ③ 72℃,

5 min Hold 2.5 取10%的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶不加入 DNA 染料) ,检测 PCR 反应的效率和特异性,通过紫外凝 US EVERBRIGHT? INC. 技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 胶成像仪或激光凝胶扫描仪观察(注意:远红外染料(波长 ≥650nm) ,肉眼无法观察) . 注:凝胶染色前先观察 YF 染料的荧光,以免与下一步的凝 胶染料发生荧光淬灭. 2.6 采用后染法,使用 DNA 凝胶染料对凝胶进行染色,观 察总的 PCR 产物或阴性对照组的 PCR 扩增产物. TUNEL 法检测细胞凋亡 注:US Everbright 提供了一系列染料的 YF Dye TUNEL Assay Kits,其中试剂盒成分包括:平衡缓冲液、YF dye TUNEL 反应缓冲和 TdT 酶.

1、试剂(自备) (1)PBS, pH7.4 (2)4%甲醛 in PBS (3)70%乙醇(可选) (4)0.2% Triton? X-100 in PBS (5)0.1% Triton? X-100 in PBS/5 mg/mL bovine serum albumin (BSA) (6)12.5 U/μL 末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (TdT) (7)5*TdT 反应缓冲液: 1M 二甲基胂酸钾,

125 mM Tris-HCl, 1.25 mg/mL BSA, pH 6.6 (8)25 mM CoCl2 溶液 (9)100 μM dATP

2、样品准备 2.1 细胞或新鲜冷冻组织切片的准备

1、 准备一份不含 TdT 酶的样品作为阴性对照. (可选步骤)

2、用PBS 清洗细胞或者组织切片两次.

3、 向上述细胞或组织切片中加入 4%甲醛, 4℃孵育

30 min.

4、用70%乙醇重悬细胞,-20℃可储存两周.(可选步骤)

5、用PBS 清洗两次.

6、促渗 加入适量的 0.2% Triton X-100 的PBS 溶液,室温 孵育

30 min.

7、用PBS 清洗两次. 2.2 石蜡组织切片的准备

1、准备一份不含 TdT 酶的样品做阴性对照.(可选步骤)

2、根据标准步骤进行脱蜡或水化处理.

3、用PBS 清洗两次.