PDF《土壤 nirS、nosZ 型反硝化菌群落结构及多样性》

Biological response of soil nirS- and nosZ- type denitrifying bacteria to dairy slurry irrigation in community structure and diversity GAO Wen-xuan1,2 , YAN Jian-hua1 , DU Hui-ying1 , ZHANG Ke-qiang1* (1.

Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin 300191, China;

2.School of Chemical Engi? neering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China) Abstract: In order to provide scientific basis for dairy biogas slurry fertilizer, pilot fields in Xushui (Hebei Province, China)were treated by conventional chemical fertilizer and dairy biogas slurry with diverse concentration and frequency, for

2 years. Soil chemical properties in different soil layers were measured and the bacteria community structures of nirS- and nosZ- denitrifying bacteria were analyzed through Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) . The results indicated that the community structure of nirS- and nosZ- de? nitrifying bacteria were sensitive to the frequency and concentration of the applied dairy biogas slurry, except that of nirS- denitrifying bac? teria in the soil of 0~20 cm. The community structures of both nirS- and nosZ- denitrifying bacteria showed significant differences in verti? cal distribution. Based on the T-RFLP data, three diversity indexes, namely, the Shannon-Wiener H′ , the Simpson D,and the Pielou E were calculated. The data indicated that different biogas slurry treatments impacted little on the diversity of nirS-denitrifiers, but had effect on the diversity of nosZ- denitrifiers. With the same N- input amount (300 kg・hm-2 ) , high concentration of dairy slurry treatment (T5)re? 2019,

38 (5) : 1089-1100 2019年5月农业环境科学学报Journal of Agro?Environment Science 高文萱,闫建华,杜会英,等.土壤 nirS、 nosZ 型反硝化菌群落结构及多样性对牛场肥水灌溉水平的响应[J]. 农业环境科学学报, 2019,

38 (5) : 1089-1100. GAO Wen-xuan, YAN Jian-hua, DU Hui-ying, et al. Biological response of soil nirS- and nosZ- type denitrifying bacteria to dairy slurry irrigation in community structure and diversity[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2019,

38 (5) : 1089-1100. 土壤nirS、 nosZ型反硝化菌群落结构及多样性 对牛场肥水灌溉水平的响应 高文萱1,

2 , 闫建华1 , 杜会英1 , 张克强1* (1.农业农村部环境保护科研监测所, 天津 300191;

2.天津大学化工学院, 天津 300072) 收稿日期: 2018-07-11 录用日期: 2018-11-02 作者简介: 高文萱 (1986―) , 女, 甘肃兰州人, 在读博士, 助理研究员, 主要从事农业废弃物资源化处理与利用研究.E-mail: wenxuangao@hotmail.com *通信作者: 张克强 E-mail: keqiangzhang68@163.com 基金项目: 公益性行业 (农业) 科研专项 (201503106) Project supported: The Special Scientific Research Fund of the Agricultural Public Welfare Profession of China (201503106) 摘要: 以河北徐水县长期定位牛场肥水灌溉试验田为研究对象, 采用末端限制性片段多态性分析 (T-RFLP) 和克隆文库相结合 的方法, 研究了不同施肥条件下 0~

20、 20~40 cm土层中土壤 nirS、 nosZ型反硝化细菌群落结构特征变化.结果表明: nirS型反硝化 细菌群落结构在 0~

20、 20~40 cm 土层中存在垂直分布差异, 且0~20 cm 土层中 nirS 群落结构对施肥种类、 肥水浓度及灌溉次数不 敏感, 而20~40 cm 土层中 nirS 群落结构对施肥条件敏感性提高;

施肥处理和土层均对 nosZ 型反硝化细菌的群落结构产生显著影 响.nirS、 nosZ 基因的多样性指数研究显示, 施肥条件下 nirS 基因多样性指数未发生显著变化, 但nosZ 基因多样性指数有明显不 同.相同施氮量 (约300 kg・hm-2 ) 的处理下, 高浓度肥水灌溉 (T5) 相比常规施肥处理 (CF) 能更好地促进两土层中nosZ基因多样性 发展.本研究还发现 0~20 cm 土层中的 nirS、 nosZ 基因多样性指数均低于 20~40 cm 土层.本研究土壤中 nirS 型反硝化细菌主要 与β-变 形菌纲的固氮弧菌属(Azoarcus)、 贪铜菌属(Cupriavidus)、 红长命菌属(Rubrivivax)和γ-变形菌纲的假单胞菌属(Pseudomonas) 和Rhodanobacter 菌属具有较近的亲缘关系, 少部分 nirS 型反硝化菌属于未知菌.土壤中 nosZ 型反硝化细菌主要 与α-变形菌纲的根瘤菌属 (Rhizobium) 、 β-变形菌纲的伯克氏菌属 (Burkholderiales) 和产碱杆菌属 (Alcaligenes) 、 γ-变形菌纲的假 单胞菌属 (Pseudomonas) 有较近的亲缘关系, 少部分nosZ型反硝化菌属于未知菌. 关键词: nirS;

nosZ;

反硝化菌;

群落结构;

牛场肥水灌溉 中图分类号: X713 文献标志码: A 文章编号: 1672-2043 (2019) 05-1089-12 doi:10.11654/jaes.2018-0901 农业环境科学学报 第38卷第5期 规模化、 集约化的畜禽养殖业发展产生了大量养 殖废水, 相对固体粪便来说, 养殖废水处理和利用率 极低, 严重制约了畜禽养殖业的可持续发展.因养殖 废水含丰富的腐植酸等有机质和氮、 磷等植物营养元 素[1-2] , 直接排放会对环境造成水体富营养化的污染. 在我国生态型畜禽养殖业发展的指导下, 将养殖废水 进行厌氧生物降解处理, 产生的沼液养分全面作为一 种优质的有机肥料源以肥水方式回归土壤, 既有效利 用养殖废水减少资源浪费, 又避免直接排放养殖废水 对环境的污染, 是最佳的废水处理和利用途径, 在农 业生产上具有很好的应用前景[3] .因此, 在提倡生态 农业的今天, 如何以沼液作为水肥安全高效地应用于 农业生产, 成为众多学者的研究方向[4-5] . 反硝化过程与土壤氮素损失和温室气体排放密 切相关, 是施肥和土壤研究中的重点问题[6] .有研究 者估计, 全球 70% 的N2O 排放来自农田, 其中农业生 态系统的排放量约占25%[7] ;

此外, 反硝化作用致使土 壤丧失 20%~30% 的氮肥, 是土壤肥力下降的重要原 因[8] .反硝化是在硝酸盐还原酶、 亚硝酸盐还原酶、 NO 还原酶和 N2O 还原酶连续催化下将 NO- 3还原为 N2 的过程.其中亚硝酸盐还原酶 (Nir) 是反硝化作用中 最关键的一步反应, 因而其编码基因 (nir) 在反硝化 研究中被广泛用作分子标记[9] .亚硝酸还原酶分为 cd1-亚硝酸还原酶和 Cu-亚硝酸还原酶两种, 分别由 nirS 和nirK 基因编码, 两者不能共存于一种微生物 中[10] , nirS 基因在反硝化菌中的存在比 nirK 更广泛[10] . nirK 基因存在于许多亲缘关系较远的菌株中, 且分子 量变化较大;

而含有 nirS基因的细菌以假单胞菌占优 势, 且在不同菌株中分子大小相似, 形态结构相对保 守[11] .由nosZ 基因编码的 N2O 还原酶催化 N2O 转化 成N2, 是反硝化过程的最后一步, 对于减少 N2O 的排 放意义重大[12-13] . 本研究以华北地区小麦-玉米轮作大田为研究 对象, 采用 T-RFLP 技术分析了不同牛场肥水浓度 和灌溉次数下 0~20 cm 以及 20~40 cm 土层中 nirS 和nosZ群落结构及多样性变化, 为牛场肥水的合理施用 提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 试验区概况 试验于

2012 年10 月至

2015 年6月进行, 采样地 点为河北省保定市徐水县梁家营长期定位牛场肥水 灌溉试验田 (115°32′6.67″E, 38°56′43.63″N) , 土壤类 型为潮褐土.徐水县位于太行山东麓, 河北省中部, 属暖温带季风型大陆性气候, 四季分明, 光照充足, 海拔 1200~2768 m, 年平均气温 12.3 ℃, 年无霜期平 均184 d, 年均降水量 546.9 mm, 年日照时数平均

2 744.9 h, 属华北平原典型农业种植区.冬小麦-夏玉 米轮作为当地主要的农业种植方式, 当年

10 月上旬 种植冬小麦, 次年

6 月中旬收获小麦, 约一周后种植 夏玉米, 当年

9 月底收获, 玉米秸秆用于奶牛的饲养. 该地区奶牛养殖业发达, 奶牛场

41 座, 奶牛存栏数达 到2.5*104 头, 每年排放废水 5*105 t.试验地种植前 耕层土壤有机质质量分数 24.5 g・kg-1 、 pH 值7.

76、 全 氮质量分数 1.39 g・kg-1 、 硝态氮质量分数 13.09 mg・ kg-1 、 铵态氮质量分数 2.24 mg・kg-1 、 速效磷质量分数 64.19 mg・kg-1 .试验土壤主要理化性质见表1. 1.2 试验设计与样品采集 试验共设8个处理, 表2为各处理下的施肥时间、 类型及成分.每处理设置 3次重复, 24个田间小区采 用完全随机区组排列.每个小区长

9 m, 宽6m, 面积

54 m2 .试验小区灌溉采用畦灌, 根据 《华北地区冬小 麦公顷产量

6000 kg (亩产

400 kg) 栽培技术规程》 (NY/T 205―1992) , 计算冬小麦需水量, 所有处理灌 水定额均为

830 m3 ・hm-2 , 灌水量利用超声波流量计 计量, 灌溉误差 1% 以内.冬小麦全生育期灌水 4次, 玉米生育期灌水 1次.供试冬小麦品种为济麦

22、 玉 米为农大 221.试验灌溉用牛场肥水为经过厌氧处 理的牛粪尿和挤奶车间冲洗水, 经检测符合 《农田灌 溉水质标准》 (GB 5084―2005) , 表3为厌氧处理后的 sulted in significant higher diversity index for nosZ- denitrifiers than conventional fertilizer (CF)did. The experimental results also sug? gested that most of the community diversity indexes of nirS- and nosZ- denitrifying bacteria were higher in the soil of 20~40 cm than those in the soil of 0~20 cm. In this study, the community of nirS- denitrifying bacteria mainly consisted of organisms close to Azoarcus, Cupriavi? dus, Rubrivivax, Pseudomonas and Rhodanobacter in Betaproteobacteria, while the community of nosZ- denitrifying bacteria mainly consist? ed of organisms close to Rhizobium, Burkholderiales, Alcaligenes and Pseudomonas in Alphaproteobacteria, and a small part belonged to un? classified organism. Keywords: nirS;

nosZ;

denitrifying bacteria;

community structure;

dairy slurry irrigation

1090 高文萱, 等: 土壤nirS、 nosZ型反硝化菌群落结构及多样性对牛场肥水灌溉水平的响应 2019年5月 灌溉肥水原液成分及含量. 土壤样品的采集: 样品采自小麦收获期 (2015 年6月12 日) , 采集深度为 0~

20、 20~40 cm 两个土层. 采用五点取样法, 每个实验小区处理中采集

5 个土 样, 将5点采集的土壤混合为

1 个样品.田间采集的 土样保存于保鲜盒内并迅速送至实验室, 于实验室内 将土样去除根系、 杂草等杂质后混匀, -20 ℃冷冻保 存用于土壤微生物分析. 1.3 分析方法 1.3.1 土壤总DNA的提取 土壤 DNA 的提取采用 FastDNA SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals, LLC) 试剂盒方法.称取

500 mg 的 土壤样品, 按试剂盒提供的操作步骤进行, 以Fast? Prep? Instrument 进行细胞破碎处理, 速度为

6 m・s-1 , 时间

40 s.提取的 DNA 在0.7% 的琼脂糖凝胶中进行 电泳检测.DNA保存于-20 ℃的冰箱中备用. 1.3.2 反硝化菌群落结构分析 反硝化菌群落结构分析采用末端限制性酶切片 段长度多态性方法分析 (Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP) , 利用反硝化菌 nirS、 nosZ 基因特异引物进行 PCR 扩增 (表4) .PCR 产物 用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0 (TaKaRa) 试剂盒进行纯化回收, 回收后的目的基因 经限制性内切酶 HhaI (TaKaRa) 酶切分析.酶切后所 得产物送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行 毛细管电泳检测.将获得的 T-RFLP 数据继续进行 处理, 去除结果中小于

50 bp 及相对丰度小于 1% 的 酶切片段. 1.3.3 序列系统发育分析 将各处理下的 PCR 扩增产物均匀混合, 经切胶 回收后连接至 pMD19? -T Vector质粒 (Takara, 大连) 、 转入大肠杆菌 JM109 感受态细胞 DH5a 内,

37 ℃过夜 培养, 经蓝白斑筛选, 挑取约

100 个阳性克隆子送至 生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行测序分析, 构 建克隆文库.将测序所得序列利用 Vector NTI 11.5.1 软件分析检查去除嵌合及错误序列后, 在GeneBank 处理Treatments CK CF T1 T2 T3 T4 T5 T6 0~20 cm NO- 3-N/mg・kg-1 3.76 18.54 16.46 15.28 50.62 71.46 20.14 11.88 NH+ 4-N/mg・kg-1 0.73 1.01 3.41 2.36 4.23 3.32 1.81 1.44 水分 (干基) 0.15 0.13 0.16 0.16 0.14 0.14 0.15 0.16 20~40 cm NO- 3-N/mg・kg-1 2.79 9.72 1.84 6.72 6.06 12.44 13.75 5.9 NH+ 4-N/mg・kg-1 0.88 1.09 3.4 1.69 2.75 2.33 2.43 0.61 水分 (干基) 0.18 0.16 0.16 0.17 0.17 0.16 0.16 0.16 注: CK 清水灌溉;

CF当地习惯施肥;

T1~T4灌溉浓度 (清水 ∶ 沼液

2 ∶ 1) , 灌溉次数 1~4次;

T5灌溉浓度 (清水 ∶ 沼液=1 ∶ 1) , 灌溉次数 2次;

T6灌溉 浓度 (清水 ∶ 沼液=4 ∶ 1) , 灌溉次数2次.下同. 表1 试验土壤基本性质 Table

1 Soil basic properties 表2 各个处理施肥量 Table

2 Fertilizer amount in treatments 处理代号 Code CK CF T1 T2 T3 T4 T5 T6 施肥时间 Fertilizer time ― 播种后、 拔节期 越冬期 越冬期、 拔节期 越冬期, 拔节期, 抽穗期 越冬期, 拔节期, 抽穗期, 灌浆期 越冬期、 拔................