PDF《,朱彩珠 2 ,葛艳1》

1 .

2 非结构蛋白

3 A BC基因序列的扩增 用上海生工试剂 盒从细 胞培养 口蹄疫病毒 中 提取总 R NA,操作步骤按试剂盒说明书进行.以提 取得到的总 R NA 为模板 ,进行反转录 P C R,反转 录 试剂 盒购 自大 连宝 生物 工程 有 限公司 ,产 品名 : R e v e r s e T r a ns c r i p t a s e X L ( A MV ) . c DNA第 一条链 的合成引物 为Ol i g o ( d T ) ,目标 c D NA 的合 成 ,引物 由 上海生 工 合成 , 引物序 列:5'

端引 物:5'

-CGGGA T C C A T C T CAA T T C C T T C T C .

3 '

,

3 '

端 引物 :

5 '

- A T C AA GC T T C T C G T GG T G T G T T C .

3 '

,设计 引 物时 分别 在5'

端和

3 '

端 引入 B a mH I 及Hi n d I I I 酶切位 点.PCR扩增 按常 规方 法进 行,1 % Ag a r o s e凝胶电泳 , 观察 结果 .

1 .

3 裹达质粒的构建

1 .

3 .

1 p T .

3 A B C 重组 质粒 的构 建:3 a b c P C R扩增片段经

1 %低融点Ag r o s e 凝胶纯化 后 ,与 T载 体连 接.T载体购 自上海生工生物技术服务有限公司, 产 品名 :T ― V e c t o r P C R P r o d u c t C l o n g i n g K i t ,连接 酶为 大连 宝生 物工 程有 限公 司产品,产 品名 :DN A L i g a t i o n K i t V e n

2 .重 组质 粒pT.3AB C转化 DH

5 C t 宿主菌.抽提质粒 ( 上海生工 U NI Q.

1 0柱离心式质 粒抽提试剂盒) ,B a mH I / Hi n d I I I双酶切鉴定,同 时进行测序 ( 由上海生工测序部完成) .

1 .

3 .

2 p E T

3 AB C 表达质粒 的构建 :重组pT.3AB C 质粒和载 体pET32a( No v a g e n公司)分别用 B a mH I 、Hi n d I I I双 酶切 ,酶切 产物

3 AB C 片段及 载体pET32a酶切 大 片段经

1 %低融 点Ag a r o s e凝胶 纯化 后连 接 ,得到 重组 质粒 p E T

3 AB C( 连接 酶 同上)转 化宿 主菌 B L

2 1 ( DE

3 ) p l y s S ( N o v a g e n公司 ) ,涂布含氨苄青霉素的 L B平板 ,得到重组克隆菌落.从 重组 菌落中提取 质粒 , B a mH U Hi n d I I I 双 酶切 ,1 % Ag a r o s e 凝胶 电泳 鉴定,同 时 ,由上海 申友生 物技 术有限公 司测序 .

1 .

4 目的蛋白

3 A BC的裹达 克隆菌落在含

5 0 o g / mL氨苄青霉素 的L B发酵 液中培养 , 待OD值达到

0 . 5左右时, 加入 I P T G诱导,I P T G 浓度为 l mmo l / L ,诱导时间

3 .

4 h ,收菌 后取 少量 样品SDS . P A GE电泳观 察结 果.1.5裹达蛋 白3AB C的鉴定 We s t e r n B l o t t i n g 方法参照'

分子克隆实验指南 进行.电转移条件为

1 0

0 V电泳

1 h ,封闭液为

5 % 脱脂 奶粉,1

0 0 mmo l / L T r i s . HC I ( p H7 .

5 ) ,

0 .

9 %N a C

1 ,

0 .

1 %T we e n

2 0 ,一抗 为 口蹄 疫病毒 感 染猪 和牛血 清(由中 国农 科院兰州 兽 医研 究所 提供),二抗 为辣 根 过氧 化 酶标记 蛋白AJG(PIERCE公 司产 品) , 底物为DAB ( 华美公司产 品) .

1 .

6 裹达蛋白的 E L I S A检测试验 经金属离子亲和层析纯化的表达蛋白用 B r a d f o r d 法确定其蛋白含 量为lO0~g/mL,用0.05mo l / L 碳 酸盐缓 冲液(pH9 .

6 )稀释至工作 浓度 后包 被ELISA板:被 检 牛血 清用

5 %兔 血清 和5% 脱脂 奶粉 及适 量 阻断剂 按1:

4 0稀释.2结果以FMD V基因组 R NA 为模板 ,R T . P C R扩增 得到

3 a b c D NA序列, 序列长度约

1 .

3 k b ,与文献报 维普资讯 http://www.cqvip.com 尤永进 , 等 .口蹄疫病毒 非结构 蛋白

3 a b c基因的克隆与表达