PDF《主要食用菌中转基因成分定性 犘犆犚 检测方法》

1 8 S r D NA 内源

5 ′ T C TG C CC TA T GA A C TT T CG A TG G T A

3 ′

5 ′ AA TT T GC G CA T TG T GC G TC A

3 ′

1 3

7 5

4 NO S 外源

5 ′ A T CG T TC AA A C A T T TG G CA

3 ′

5 ′ A T TG C GG GAC T CTAA T C A TA

3 ′

1 6

5 5

4 终止子 B A R 外源

5 ′ A C A AG CA C GG T CAA CT T CC

3 ′

5 ′ AAAC C CA C GT C A T G CC A GT T C

3 ′

3 9

8 5

4 目的基因 GU S 外源

5 ′ G G TC A GT C CC T T A T GT TAC G

3 ′

5 ′ G T GTA G AG CA T T A C GC T GC G

3 ′

5 4

5 5

4 报告基因 N P TⅡ 外源

5 ′ AG GC T A T T CG G CTA TG A CT G G

3 ′

5 ′ G C GG T CC G CC A CA C CC A GC C G

3 ′

6 0

0 5

4 标记基因 5.

1 9 研究转基因食用菌用的阳性质粒p

3 0

1 b G 1, 含有终止子 NO S、 香菇三磷酸甘油醛脱氢酶( G P D) 基因启动子、 目的基因 B AR、 报告基因 GU S等元件, 从中提取 D NA 溶液. 5.

2 0 溴化乙锭( E B) :

1 0m g / m L. 5.

2 1 D NA 分子量标准. 5.

2 2 5*T B E缓冲液: T r i s5 4g , 硼酸2

7 5g , 0. 5m o l / LE D T A( p H 8.

0 )

2 0m L加蒸馏水至10

0 0m L. 5.

2 3 6*加样缓冲液( 电泳前沿指示剂) : 0.

2 5% 溴酚蓝, 0.

2 5% 二甲苯青 F F,

3 0% 甘油水溶液( 或40%蔗糖) .

2 犁荦/2

0 7 4―2

0 0

8 www.grainnet.cn 5.

2 4 E p p e n d o r f离心管: 1. 5m L, 2m L两种规格, 用前须高压灭菌处理. 5.

2 5 P C R 反应管:

2 0 0μ L, 用前须高压灭菌处理.

6 仪器设备 6.

1 研钵或电动研磨器. 6.

2 恒温水浴锅或干式恒温器: 恒温范围为室温~1

0 0℃, 精度为±0. 5℃. 6.

3 电子天平: 感量为0.

0 0 1g与0.

0 0

01 g . 6.

4 台式高速离心机, 低温冷冻高速离心机, 小型瞬时离心机. 6.

5 高温干燥箱. 6.

6 冷冻、 冷藏冰箱. 6.

7 制冰机. 6.

8 旋涡振荡器. 6.

9 高压灭菌锅. 6.

1 0 p H 计. 6.

1 1 微量移液器: 体积范围为0.

2 0μ L~2. 0μ L, 2μ L~2 0μ L,

2 0μ L~2

0 0μ L,

2 0 0μ L~10

0 0μ L, 枪 头用前应高压灭菌处理. 6.

1 2 D NA 浓缩仪. 6.

1 3 核酸蛋白分析仪. 6.

1 4 纯水机. 6.

1 5 P C R 超净工作台或生物安全柜. 6.

1 6 P C R 仪. 6.

1 7 微波炉. 6.

1 8 电泳仪. 6.

1 9 电泳槽. 6.

2 0 凝胶分析成像系统.

7 测定方法 7.

1 能恋某樘峒芭ǘ炔舛 7. 1.

1 能恋奶崛 称取约5 0g烘干后的食用菌样品, 经干热灭菌(

1 5 0℃干热处理2h) 或1

2 0℃、

3 0m i n高压消毒处 理的研钵或在粉碎机中研磨成颗粒大小约0. 5mm 左右的粉末, 备用.称取1

0 0m g烘干后研磨成粉的 样品于1. 5m L的离心管中, 加6

0 0μ L2%C TA B缓冲液, 5μ L 蛋白酶 K(

2 0m g / m L) , 5μ LR n a s eA (

1 0μ g / m L) , 剧烈振荡3 0s以上,

6 5℃温浴1h, 期间定期振荡.加6

0 0μ L水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊 醇(

2 5∶2 4∶1 ) , 剧烈振荡, 1. 2*1

0 4 离心1 5m i n.取上清液, 再加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异 戊醇(

2 5∶2 4∶1 ) , 振荡混匀, 1. 2*1

0 4 离心1 5m i n .取上清液, 加0.

8 倍体积异丙醇, 混匀, 1. 2*

1 0

4 离心1 0m i n .取沉淀, 加入4

0 0μ L氯化钠( 1m o l / L) 于6 5℃温浴中溶解, 加等体积的水饱和酚∶ 三氯甲烷∶异戊醇(

2 5∶2 4∶1 ) , 振荡, 1. 2*1

0 4 离心1 5m i n.取上清液, 加2倍体积的无水乙醇, 轻 微振荡, 1. 2*1

0 4 离心1 0m i n. 取沉淀,