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? 临床经验 ? 传染性非典型肺炎患者不同病程粪便标本中SARS-CoV的分离与鉴定 田薇, 邓亚军, 吴清发, 王绪敏, 杨玲, 张峰, 刘晨辉, 包其郁, 汪建, 杨焕明, 刘明旭 田薇, 西安交通大学医学院卫生部法医学重点实验室 陕西省西安市710061 邓亚军, 杭州华大基因研发中心 浙江省杭州市

310008 吴清发, 王绪敏, 杨玲, 张峰, 刘晨辉, 汪建, 杨焕明, 刘明旭, 中科院北 京基因组研究所, 北京华大基因研究中心 北京市

101300 包其郁, 浙江大学沃森基因组科学研究院, 杭州华大基因研发中心 浙江省杭州市

310008 项目负责人: 刘明旭, 101300, 北京市, 北京空港工业开发区 B-6, 北京华大 基因研究中心.

liumx@genomics.org.cn 电话 010-80481102 传真 010-80498676 收稿日期: 2003-12-12 接受日期: 2004-01-13 摘要 目的: 从粪便标本中分离并鉴定SARS-CoV. 方法: 粪便浸出液接种 Vero-E6 细胞 盲传至出现明显的 细胞病变效应(CPE) 并能稳定传代. 采用电镜法和 RT- PCR 技术鉴定细胞培养物中的 SARS-CoV (本实验均在 BSL-3实验室完成). 结果: 大部分样本用 Vero-E6 细胞盲传

3 代后发现明显的 CPE 并能稳定传代. 电镜负染检查 出现 CPE 的细胞可 查见病毒颗粒;

培养物上清RT-PCR扩增均为阳性. 粪便样 本直接用RT-PCR检测 阳性率仅为50% 细胞培养的检 出率为

73 . 结论: 采用细胞培养结合RT-PCR技术检测粪便标本SARS- CoV比粪便标本直接RT-PCR的阳性率高. 田薇, 邓亚军, 吴清发, 王绪敏, 杨玲, 张峰, 刘晨辉, 包其郁, 汪建, 杨焕明, 刘 明旭. 传染性非典型肺炎患者不同病程粪便标本中SARS-CoV的分离与鉴定. 世界华人消化杂志 2004;

12(5):1246-1248 http://www.wjgnet.com/1009-3079/12/1246.asp

0 引言 SARS 冠状病毒(SARS-CoV)是一种新的冠状病毒[1-6] 经呼吸道传播 传染性强 潜伏期短 死亡率高 主要 分布在人体的肺 肝等器官及全身的淋巴组织 同时也 可存在于血液和粪便[3, 7] . 迄今为止 关于 SARS-CoV 的分离培养 主要见于 对鼻咽拭子等呼吸道样本以及尸解组织器官的病毒培 养 尚未见对患者粪便标本进行 SARS-COV 分离培养 的报道. 我们采用体外病毒分离技术从北京佑安医院 2003-05-16/06-09 收集的

12 例患者

30 份标本中 分 离获得了 SARS-CoV 原始分离物.电镜和 RT-PCR 技术 均证实细胞培养物中含有 SARS-CoV. 现报道如下:

1 材料和方法 1.1 材料 病例与样品: 粪便标本由北京佑安医院提供 时间 2003-05-16/06-09 所有患者都符合 WHO 对SARS 疑似病例的诊断定义 (http://www.who.int/csr/sars/ guidelines/en).

12 例SARS 患者中男

5 例女7例27-

63 岁 病程 12-65 d (从发病之日计算) 共30 份粪 便样本(部分样本来自同一患者的不同病程). 引物: 根据 SARS-CoV BJ01 株基因组序列(AY278488),设计

4 对引 物(其中

2 对为巢式引物) 序列如下: SARS73:

5 CA AAACCCCAACTTTGAAAT

3 和5CAGAGGTGGC AACACTGTAA

3 扩增产物长度为

226 bp SARS73 巢式引物(SARS73N):

5 CTTTTATTGAGGACTTGCTCT

3 和5ACTTCTGCGCACAAATGAG

3 扩增产物长 度118 bp;

SARS81:

5 AACTCCTGGAACAATGGAAC

3 和5TAAGCCACATCAAGCCTACA

3 扩增产物 长度为

238 bp SARS81 巢式引物(SARS81N):

5 TTCC TAGCCTGGATTATGTT

3 和5AGCACAAAACAAG CAAGTGT

3 扩增产物长度120 bp. 上述引物分别位于 SARS 冠状病毒 S 糖蛋白和 M 蛋白基因的保守区. 1.2 方法 1.2.1 粪便样本处理 挑取少许样本至一 1.5 mL 离心管 中 加入