PDF《ISPM 27 号标准 限定有害生物诊断规程》

13 国际植物保护公约 DP 13-5 菌(Erwinia pyrifoliae)(Kim 等,1999)、从西班牙坏死的梨花中分离到的 Erwinia piriflorinigrans(López 等,2011)、日本最近报道的 Erwinia uzenensis (Matsuura 等,2012)、日本报道的引起细菌性梢枯病的其他欧文氏菌属细菌 (Tanii 等,1981;

Kim 等,2001a,2001b;

Palacio-Bielsa 等,2012),以及花枯 病的致病因子丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. syringae).火疫病的确切 诊断应该通过实验室检测才能完成. 3.1.2 取样与样品制备 植物材料采集后应尽快检测,处理前也可在 4-8 ?C 下最长保存一个星期.采集 样品时,以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染,在分离细菌或提取 DNA 时尤其如此. 样品处理应采用对分离、血清学检测和多聚酶链式反应(PCR)检测都有效的 通用程序.如Gorris 等(1996)所述,为了成功进行富集,要使用新制备的抗氧化 剂浸渍缓冲液(聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-10,20 g;

甘露醇,10 g;

抗坏血酸, 1.76 g;

还原型谷胱甘肽,3 g;

磷酸盐缓冲液(PBS),10 mM,1L;

pH 7.2;

过 滤除菌过滤).样品也可以用无菌蒸馏水或 pH 7.2 的PBS(NaCl,8 g;

KCl,0.2 g;

Na2HPO4・12H2O,2.9 g;

KH2PO4,0.2 g;

蒸馏水,1L)处理,直接用于分离、免 疫荧光检测或 PCR 检测. 应小心选择表现出最典型症状花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实,并在可能的情 况下带有菌溢的植物部位(花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实).处理用的材料要从 病斑最先发病部位挑取.将植物组织切成大约 0.1-1.0 g 的小块,按照 1:50(w/v) 的比例在抗氧化剂浸渍缓冲液、PBS 或无菌蒸馏水(如前段所述)中轻轻挤压,静 置至少

5 min,并在冰块上放置几分钟.从每份浸出液中取出

3 份样品(每份

1 mL),转移至无菌离心管中,其中一管保存在C20 ?C 下供后续 PCR 分析,另一管 调节至含 30%甘油并保存在C80 ?C 下供必要时的验证检测.第三管在酶联免疫吸附 试验(ELISA)或PCR 前置于冰块上进行富集,并在选择性培养基上进行分离(图1).如果要进行免疫荧光检测(即免疫荧光检测是选择性的),应在样品浸渍的 同一天制备并固定玻片.方便时应尽快使用保存在C20 ?C 下的浸出样品进行 PCR 检测. 3.1.3 分离 3.1.3.1从显症样品中分离 一般而言,建议在三种培养基上涂板以尽可能检获梨火疫病菌,样品条件不好 时尤应如此.取决于样品中微生物群的数量和构成,每种培养基的效率可能高低不 一.已通过两组环形试验对三种培养基(CCT、金氏 B 和果聚糖)进行过验证,其 中果聚糖培养基出菌率最高. 当症状到了后期,或者侵染后的环境条件不适于细菌繁殖时,可培养的梨火疫 病菌细胞数量可能很少.在这些情况下进行分离可能导致涂板中只有很少几个病原 DP

13 限定有害生物诊断规程 DP 13-6 国际植物保护公约 细胞,因而被腐生和拮抗细菌淹没.如果怀疑出现这种情况,应重新对样品进行检 测,并且/或者在分离前进行富集.已报道可通过铜处理诱导离体或水果上的梨火疫 病菌进入可逆的活的不可培养状态(VNBC)(Ordax 等, 2009),这可能是导致假 阴性分离结果的原因.建议的培养基成分说明如下: - CCT 培养基分两部分制备.第一部分含:蔗糖,100g;

山梨糖醇,10g;

硫酸 四癸钠,1.2 ml;

结晶紫,2 ml(0.1%乙醇溶剂);

营养琼脂,23 g;

蒸馏水, 1L;

pH 7.0C7.2;

115 ?C 高压灭菌

10 min.将灭过菌的培养基冷却至大约