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磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

1 生化科技 Enriching Biotechnology 使用说明书 【产品名称】Protein A 琼脂糖磁珠免疫沉淀(IP)试剂盒 【产品型号】MAg25K/Protein A Kit 【目录号】P25 【产品介绍】 Enriching Beads? Protein A 琼脂糖磁珠免疫沉淀(IP)试剂盒包含磁珠悬浮液、结合& 清洗液、细胞裂解液、洗脱液和中和液,可以在

30 分钟内完成完整的 IP 实验.

此产品 适用的范围广泛,例如细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水. 【产品信息】 内容 P25-002 P25-005 储存 MAg25K/Protein A 2mL 5mL 2~8℃ for

1 year PBST pH 7.4 20mL 50mL 2~8℃ for

1 year PBS pH 7.4 不提供 NP40 Cell Lysis Buffer 10mL 25mL -20℃ for

1 year Elution Buffer 2mL 5mL 2~8℃ for

1 year Neutralization Buffer 1mL 2mL 2~8℃ for

1 year 【操作流程 】 磁珠预处理 1. 移液器吹打或漩涡振荡器混匀磁珠,取50?L 磁珠悬浮液(10%,v/v)至离心管中,放 入磁力架磁性分离去除保存液;

注:客户可根据实际需要适当增减;

2. 加入

100 ?L PBS 混匀磁珠(颠倒

30 秒或者旋涡振荡器混匀),磁性分离去除上清 液(重复

2 次);

细胞裂解液制备 细胞裂解液制备可参考标准步骤,我们建议采用本试剂盒提供的 NP40 Cell Lysis Buffer (注:如有需要可添加蛋白酶抑制剂如:PMSF 1mM 等,如细胞为原核细胞,则不建 议用 NP40 Cell Lysis Buffer 而采用 PBS 进行超声破碎的裂解方式) 抗体结合 1. 用100?LPBST 稀释 2~20?g 抗体样品,稀释后加入到装有磁珠的 1.5 或者 2mL 或者 离心管中;

注:实际抗体使用量需根据实验摸索,可参看磁珠对应不同抗体亚型的亲和力表;

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2 生化科技 Enriching Biotechnology 2. 将上述混合物放入摇床或旋转混合仪室温或 37℃颠倒混匀或者涡旋混匀 10~15 分钟;

3. 将装有磁珠抗体复合物的离心管放入磁力架,待磁珠完全贴壁后,去除上清液;

4. 用100?LPBST 洗涤磁珠-抗体复合物

3 次. 抗原沉淀反应 1. 抗原吸附:向上一步装有磁珠-抗体复合物的离心管中加入制备好的细胞裂解液 100~1000?L,用移液枪吹打混匀;

2. 37℃颠倒混匀或者低速涡旋混匀 15~20 分钟,使抗原和结合抗体的磁珠结合;

注:为使集合更充分,孵育时间和稳定可根据实际需求进行调整;

3. 将上一步的离心管和混合物放入磁力架,吸取上清(上清可丢弃也可保存做后续分 析);

4. 取200?L PBS 洗涤磁珠-抗体-抗原复合物

3 次;

5. 洗涤完成后用 100?L PBS 重悬磁珠,用于下一步操作. 注:抗原洗脱前务必将磁珠转移新的离心管,避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱 抗原洗脱 本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案,操作者可根据后期检测的需要选择不同 的抗原洗脱方法. 变性洗脱法: 1. 将装有磁珠-抗体-抗原复合物的离心管放入磁力架,待磁珠贴壁完全后吸去上清;

2. 向上述离心管中加入25?LElution Buffer和5?L 5x SDS-PAGE Loading Buffer(自备) 再用移液器重悬复合物;

3. 95~100℃煮沸5~10分钟;

4. 将煮沸后的离心管放入磁力架取上清做后续分析(注:上清液中含有抗原勿丢 弃). 非变性洗脱法: 1. 将沉淀抗原第5步骤中的磁珠放入磁力架,磁性分离去除上清液;

2. 向离心管中加入约30?L的Elution Buffer,用移液器轻轻混匀避免气泡产生,颠倒混 匀或者低速涡旋混匀2~5分钟;

3. 将磁珠放入磁力架,磁性分离收集上清(注:上清液中含有抗原勿丢弃);

4. 中和:上述步骤收集上清中抗原,若需做功能验证需加入Neutralization Buffer中和 洗脱液(例:100?LElution Buffer加入10 ?LNeutralization Buffer即可). Target Antigen Detection(沉淀后抗原分析) 磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

3 生化科技 Enriching Biotechnology A. 变性洗脱抗原适用方向 1. 蛋白染色鉴定 2. Western blotting 3. SDS-PAGE for Fluorography B. 非变性洗脱抗原适用方向 1. 蛋白特征分析 2. 免疫 3. 酶学研究 4. 氨基酸序列分析 5. 蛋白晶体结构分析 C. 未做洗脱抗原适用方向 1. 蛋白相互作用 2. 酶学研究 3. 生物分析 4. 免疫学分析 磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

4 生化科技 Enriching Biotechnology 附表一:Protein A,G,L 与不同来源类型的抗体亲和性比较: 种类 Species 亚型 Antibody Class 蛋白 A Protein A 蛋白 G Protein G 蛋白 L Protein G IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM + - +++ IgD - - +++ Human IgA IgG1 + ++ +++ IgG2a IgG2b IgG3 Mouse IgM - - +++ IgG1 + ++ +++ IgG2a IgG2b - + Rat IgG2c IgG1 + +++ - Cow IgG2 IgG1 + +++ - Goat IgG2 IgG(ab) + - NA IgG(c) + - NA Horse IgG(T) - +++ NA Rabbit IgG Pig IgG +++ + + Dog IgG Chicken IgY - - NA 英芮诚生化科技(上海)有限公司 地址:上海市杨浦区翔殷路

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