PDF《蛋白样品制备全攻略》

2006 年Wandless 博士在 Cell 杂志上发表题为 《A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.》 的文章. 几天之内, 他就收到超过五十个来自世界各地的研究团队 的来信请求分享这组试剂.这项技术也受到了 全世界的关注,很多公司希望将它商业化.最终,表达巨头 Clontech 公司获得了专利授权. ProteoTuner 系统让研究人员能利用小分 子调控细胞内任何目的蛋白的表达水平,比RNAi 更快更准. 这项技术已经成功应用于多个 物种和应用中, 并在 Cell、 Nature Method、 JBC 上发表了多篇文章. 简单但行而有效的技术 ProteoTuner 系统有两个主要元件来控制 目的细胞的表达水平:

12 kDa 的破坏稳定结构域(destabilizing domain, DD) 当它与目的蛋白融合时,就成 为蛋白酶体降解的目标, 从而破坏蛋白的稳定. 载体上 DD 编码序列位于多克隆位点(MCS) 的上游. 膜通透性的小分子配体 Shield1 它的分子 量很小,只有

750 Da.它能保护 DD 融合蛋白 免受降解,使融合蛋白在细胞内累积.稳定作 用只需 15-30 分钟即可完成, 不过为保险起见, 最好还是做个时间进程实验,来评估你的目的 蛋白的稳定速率. Shield1 的浓度可以根据目的 蛋白量进行调节. Shield1 也可以从细胞中洗脱 出来,再次破坏细胞的稳定.这个过程是可逆 的,而且可以反复操作很多次. 快速且可逆的步骤 一旦你的细胞被转染/感染,ProteoTuner 的操作步骤非常简单快捷.为了维持目的蛋白 的稳定,向细胞培养基中加入 Shield1 稳定配 体,同时在另一份中不加入作为阴性对照.加 入的 Shield1 能保护你的 DD 标签蛋白不被蛋 白酶体降解,在细胞内迅速积累. 相反地,为了降解你的目的蛋白,就将细 胞转移至不含 Shield1 的培养基中.没有了 Shield1 的保护,目的细胞就迅速降解.同时, 在另一份细胞持续加入 Shield1 作为阳性对照. 形式多样 ProteoTuner 系统有多个版本可供挑选, 包括质粒、反转录病毒和慢病毒,你可以根据 细胞系来自由选择.另外,还有多........