PDF《蛋白样品制备全攻略》

蛋白样品制备全攻略 双向电泳可不是一件容易的差事,花银子花时间不说,结果还很难重复.

想要搞定双向电泳,关 键在于建立一套有效、可重复的样品制备方法.方法是多种多样的,不过都基本遵循以下的原则: 1. 样品缓冲液中离子浓度的控制 2. 溶解包括疏水蛋白在内的所有蛋白质 3. 防止聚焦过程中已溶解蛋白质的聚焦和 析出 4. 防止样品制备过程中及其后蛋白样品的 酶或化学降解等的修饰反应 5. 去除或完全降解核酸及其他干扰分子 6. 去除高丰度或不相关的蛋白质,提高低 丰度蛋白的浓度,使其达到检测要求 提高分辨率和确保重复性是双向电泳实验 最重要的两个目标.蛋白样品制备在实现这两 个目标的过程中起到了核心作用.Bio-Rad 公 司的 ReadyPrep 试剂盒通过试剂增溶或差异 溶解来减少脱尾或降低样品复杂性,从而成为 用户可靠的实验工具. ReadyPrep 产品线包含 一系列 2-D 样品制备试剂盒,不仅适用于通用 样品(总蛋白)处理,而且可以将复杂样品按 特定方法分级.处理通用样品的试剂盒包括总 蛋白抽提和蛋白净化(clean-up) .样品分级试 剂盒可用来降低样品复杂程度,同时有助于低 丰度蛋白的富集和鉴定.这类试剂盒又分为两 种, 一种是基于蛋白不同的亚细胞定位来分离, 另一种是对细胞总蛋白进行分级,从而适合于 总蛋白质组分析. 从血清或血浆中提取的低丰度蛋白经常会 受到白蛋白和 IgG 的干扰.白蛋白在血清总蛋 白中的含量约为 60-70%,IgG 虽小,也不可轻 视,占了总蛋白的约 10-20%.这两种蛋白异 军突起,常常掩盖了其它类似大小的蛋白,使 我们无视低丰度蛋白的存在,也降低了双向电 泳的分辨率.因此,在分析目的蛋白之前,我 们一定要先干掉白蛋白和 IgG 这两个家伙. 样品中的核酸会对等电聚焦的结果产生干 扰:DNA 复合物在变性条件下发生解离而使溶 液的粘稠度增加, 可阻碍蛋白质进入 IPG 胶条, 并减慢蛋白质在胶条中的移动速度.DNA 也会 与样品中的某些蛋白质结合,出现人工假象和 条纹. 具体的解决方案如下: 去除盐分、去垢剂、脂类、酚类 ReadyPrep 2-D 净化试剂盒 ReadyPrep 2-D 净化试剂盒可去除蛋白 样品中的去垢剂、盐分、小肽、脂类和酚类化 合物.这些物质会干扰双向电泳.本试剂盒含 有不受去垢剂、离液剂或其它实验中常用试剂 干扰的沉淀试剂,可充分沉淀样品蛋白,并保 证了蛋白样品的回收效率和浓度. 去除白蛋白 Aurum AffiCGel 蓝胶小型试剂盒和层析 柱 通过亲和层析,AffiCGel 蓝胶能去除血清 和血浆中 90%的白蛋白. 去除白蛋白/IgG Aurum 血清蛋白 Mini 试剂盒 Aurum 血清蛋白Mini 试剂盒包含了Micro Bio-Spin 层析柱,其中填充了 Affi-Gel 蓝胶和 Affi-Gel Protein A 填料.这两种树脂混合物能 同时选择性地结合白蛋白和 IgG,处理过的样 品无需额外纯化,就能立即用于 2D 的分析. 一次纯化就能搞定两个东西, 操作步骤减少了, 效率也提高了. 去除 DNA 最简单的方法就是酶解.当样品用高 pH 溶液裂解后,在溶液中加入核酸内切酶,既能 有效降解核酸,又能使内源性蛋白酶的活性最 低.也可以在冰浴环境中,通过超声处理的方 法将大片段的核酸打断成小片段后,直接进行 双向电泳. 总蛋白抽提 ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (总蛋白) ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (总蛋白) 是一种操作简单、快捷、重复性好的试剂盒, 用来抽提适合于双向电泳的细胞全蛋白.试剂 盒中离液性超强的抽提溶液含有兼性去垢剂 ASB-14, 从而使该溶液能溶解各种细胞的全蛋 白. 根据亚细胞定位分步抽提 ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (膜I) 本试剂盒是利用 Triton X-114 在一定温度 下可与水相分层的原理将蛋白分离.经过最后 一步的离心步骤,溶液被分级成上层的水相和 下层的高去垢剂相. 此外还有一些难溶的沉淀, 这些沉淀主要是更加复杂的膜蛋白.进入上下 两相的蛋白再用 ReadyPrep 2-D 净化试剂盒 (含在本试剂盒中)净化, 以去除抽提过程中混入 的可能干扰 IEF 的物质. ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (膜II) 膜II 试剂盒做为其它膜蛋白分离试剂盒的 补充,是专门为有效分离较为复杂的膜蛋白而 优化的.抽提的过程用到了碳酸钠和超速离心 机. 试剂盒中的 2-D 水化/上样缓冲液含有强离 液性的兼性去垢剂 ASB-14. ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(信号) 绝大多数细胞的胞浆膜都有富含神经鞘磷 脂和胆固醇的微区域(酯筏) .与这些脂筏相联 系的蛋白往往是参与物质跨膜转运或信号转导 的蛋白质.这类蛋白包括 GPI 锚订蛋白、 caveolin 、 caveolae (caveolin-associated proteins)、酰化酪氨酸激酶、G 蛋白异三聚体, 以及一些含跨膜结构域的蛋白 (Simons and Ikonen 1997, Brown and Rose 1992, Parton and Simons 1995, Anderson et al. 1992) .与 胞膜当中这些富含酯类的微区域相结合的蛋白 质在4°C Triton X-100 的溶液中难溶.ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(信号) 利用这一 原理将信号蛋白有选择性地加以回收. ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(胞浆/核) ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(胞浆/核)使用 一种专门配制的缓冲液和差速离心将细胞核完 整地分离出来(Dignam et al. 1983, Zerivitz and Akusjarvi 1989).本试剂盒包含一种强离 液性的缓冲液,可有效溶解膜蛋白,并可直接 用于双向电泳分离.如要对胞浆组分进行分析 可以将蛋白样品先用试剂盒中带的 ReadyPrep 2-D 净化试剂盒处理. 根据不同的溶解度分步抽提 ReadyPrep 顺序抽提试剂盒 ReadyPrep 还原/烷化试剂盒 ReadyPrep 顺序抽提试剂盒是为全蛋白 质组分析而设计的.本试剂盒将初始蛋白样品 根据溶解性的不同分成三个组分.当蛋白的亚 细胞定位不能确定时,本试剂盒还可以用来搜 寻特定的蛋白. 依照溶液溶蛋白能力的增加将 蛋白样品进行顺序抽提可以溶解更多的蛋白, 从而使蛋白质组的信息更全面. ReadyPrep 还原/烷化试剂盒首先将半胱 氨酸残基之间的二硫键还原,然后将还原出来 的巯基烷化, 使得这些基团永久保持还原状态. 这样做有助于防止假蛋白点的出现并能让 IPG 胶条中更多的蛋白质转移到第二向的SDS-PAGE 胶中.本试剂盒对分析碱性蛋白质 特别有效.因为胶条碱性部位的 DTT 容易电 离,在电场作用下迁移出 IPG 胶条,从而使胶 条中 DTT 减少,蛋白质二硫键重新形成.绝大 多数生物含有较多数量的碱性蛋白,这类蛋白 的pI 值高于 pH 7. ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (可溶/不可 溶) ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (可溶/不可 溶) 可将细胞全部蛋白分为两个组分――以亲 水性蛋白为主的可溶性组分和以疏水性蛋白为 主的不可溶组分.这种简单的分级方法可有效 降低样品的复杂性,提高低丰度蛋白的检测效 率, 从而在总体上改善总蛋白质组的分离效果. 要想得到好的双向电泳结果,绝大多数样 品都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的条 件.所以革命尚未成功,同学仍需努力! 保持蛋白的还原状态 (生物通 余亮) 新一代的体外表达系统 与其它表达系统相比,体外表达是获取蛋白的最快方法.从PCR 或者质粒模板开始,到体外蛋 白质的合成及功能检测仅需几个小时,省去了转化、转染、挑克隆等诸多繁琐的步骤,且不需要任何 宿主菌,因此,特别适用于体外合成毒性蛋白及易受蛋白酶水解的蛋白质. 市场上销售的体外表达系统多是由 E.coli S