PDF《DO I :》

0 , 并用它成功表达了幽门螺杆菌尿素酶 B 亚单位的分子内佐剂疫苗 .

1 材料与方法 1.

1 材料 菌株及质粒: DH5α、JM109 E . coli 本室保种, Pinpoint Xa -Ⅰ 为Promega 公司产品, 含有 LT 的产肠毒素大肠杆菌 E . coli H44815( LT+ , ST+ ) 购自中国药品生物制品检定所;

含有幽门螺 杆菌( Helicobacter pylori , Hp) 尿素酶 B 亚单位( UreB) 基因的质粒 pBHP 由本室构建. 工具酶: 各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接 酶、小牛肠碱性磷酸酶均购自华美生物工程公司;

IPTG、GM1 神 经节苷脂为Sigma 产品, 其它化学试剂均为分析纯. 兔抗 LT 多 抗血清购自上海市卫生防疫站, 兔抗 Hp 多抗血清本室制备, HRP -羊抗兔 IgG 抗体( 酶标二抗) 购自武汉博士德生物科技有 限公司.

1275 第25 卷第

14 期2003 年7月第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol. 25, No.

14 Jul.2003 DOI : 10. 16016/ j .

1000 - 5404. 2003. 14.

022 1.

2 方法

1 . 2.

1 细菌基因组 DNA 、质粒提取、DNA 片段回收纯化 采 用上海 Sangon 公司 UNIQ10 小量质粒抽提试剂盒和 Silver Beads 胶回收试剂盒, 方法按说明书进行.

1 . 2.

2 LTB 融合表达质粒的构建 LTB DNA 序列 ATG 上游 约16 bp 位置存在一个 EcoRⅠ 酶切位点 , PCR产物经 EcoRⅠ 和EcoRⅤ双酶切并纯化后与同样 EcoRⅠ 和EcoRⅤ双酶切的 Pin- point Xa -Ⅰ 载体相连接, 构建 LTB 融合表达质粒 pLV2 .

0 , 转化 DH5α .

1 . 2.

3 DNA 酶切反应、连接、转化 按参考文献[ 2] 进行.

1 . 2.

4 PCR 根据 GenBank 公布的 hLT 基因序列[ 3] , 设计了 两条引物分别为: 上游引物

5 ′ -agaggcagatattttcagactatcag -3′ , 下游 引物5′ -cagatatcggtgcgtagttttcatactg -3′ . 上游引物位于 LTB DNA 序列ATG 上游64 bp 位置, 下游引物位于 LTB

3 ′ 端终止子上游部 分序列, 同时引入 EcoRⅤ 酶切位点, 并在 LTB 最后一氨基酸 ( Asn) 残基密码子 AAC 与EcoRⅤ酶切位点之间设计增加了编 码Tyr -Ala -Pro-Ile 的12 个核苷酸. 以E.coli H44815 基 因组 DNA 为模板, 按常规 PCR 方法进行扩增. 反应条件:

94 ℃预变 性5min, 加入 Taq DNA 聚合酶, 然后按如下参数循环:

94 ℃,

1 min,

55 ℃,

1 min ,

72 ℃,

1 min , 最后一个循环结束后

72 ℃反应

10 min.

1 . 2.

5 DNA 序列分析 用双脱氧法测序, 由北京赛百盛生 物公司完成.

1 . 2.

6 蛋白表达分析 经筛选、鉴定的阳性重组子转化到 E . coli JM109 , 1.

0 mmol L IPTG 诱导

9 h, 用SDS-DAGE 和West- ern blotting 分析融合蛋白的表达. 蛋白电泳采用 Bio -Rad 电泳 系统, 5%积层胶,

12 %分离胶, Tris -甘氨酸电泳缓冲液. 电泳完 后, 一部分考马斯亮蓝染色, UVP 扫描;

另一部分电转移(

40 mA,

2 h) 至硝酸纤维膜上 , TBST 封闭,

4 ℃过夜;

分别加入兔抗 LT 多抗血清 免抗 Hp 多抗血清( 一抗),

37 ℃温育

1 h , TBST 洗涤3 次, 每次

10 min;

再加入 HRP -羊抗兔 IgG 抗体( 酶标二抗),

37 ℃30 min, TBST 洗3遍, 最后加入底物显色.

1 . 2.

7 GM1 -ELISA 以GM1 神经节苷脂包被聚乙烯塑料板,

4 ℃过夜, 加入细菌沉淀超声上清,

37 ℃,

30 min;

TBST 洗5次,

10 min 次;

加入抗 LT 多抗血清,

37 ℃,

30 min;

TBST 洗5次;

再 加羊抗兔HRP 酶标二抗, TBST 洗5次后加 OPD 底物显色.

2 结果 2.

1 PCR 扩增 LTB 基因 以E.coli H44815 基因组 DNA 为模板进行 PCR扩增, 产物 经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 得到了一条长约