PDF《关键词人白介素_ 1》

5 a 新鲜过夜培养物按

1 :

1 0 接种

1 0 mI 的L B培养基中( 古80g/mI 氨苄西林 ) .

3 O ℃摇 睐培 养至

0 n 为05,转至

4 2 C继续培 养5h=甩

1 0%S D S - P A GE电泳对培养物进 行分析 . 结果1hIL-18基因的克隆 从人 胎肝 组织中提取 mR NA, 经RT―PCR扩增 后,用1%琼 脂糖电泳分 析扩增结 果.产物长度 为492bp(图1).2重组 质粒的酶 切 鉴定 P C R产物直接克隆到 p G E M― T( e a s y ) 载体 中, 经EcoR1酶 切鉴 定插入 片段大 小约500bp,初步 证 实所 克隆 基因为IL-18基 因 片段 ( 图2).图1RT- P CR法舟离 h i [ , I 8基圆的电诛 鉴定 F;

日1Ag … g d e l e c t r o p h o r e s l s o f h i I 一18geneamp l i l i e d RT PCR L: H u ma n l i v e r t i s s u e M : k D NA E o a R1 / H h l d ⅢMa r k e r

2 b p 圉2重组质粒 p GE M. T I I

1 8的酶切鉴定 图谱 Fi g

2 I d e n t i f i c a t i o n D f ~ e o m b i n a n t p / a s mi d I ~ GEM ― T- [ I A8 d i g e s t e d b y r e s t r i c t i o n e d o nu c l ~ s e M ) . DNA E e o R I / I - l i n d 呵Ma r k e r P: Ⅲ o m b i n a r t t p l ~ml d p GE M- T _ I L l

8 3 h l L -

1 8基因片段 的序列分析 采用 口GEM通用引物 . 以变性 的重组质粒双链 DN A为模板对其进行 了全 自动序列分析 . 所获基因片段为

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2 b p ( 包括两端的酶切位点) . 结果与 Ge n e B a n k中序列完全一致( 图3)c4重组 蛋 白的 表达 利用体外重 组 技术 构建 含有hlL.18基 因的重 组表达 质粒(图4),转化宿主菌DH5 a , 经热诱导后, 表达 了一个分子量约 为17000D的特异蛋白.重组蛋白 包涵体形式存在, 薄层扫描 结果表明, 表达的重组 蛋白占细 菌总 蛋 白的

2 7 .

2 %( 图5).维普资讯 http://www.cqvip.com

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6 中国病毒学第13卷 T A C T T T G G C 从GCTTG从TCT^从TTATCAGTCATAAG从^TTTG从TGACc^AGTTCrCTTcATTGACC从GGA^ATCGGCCTCTATTTG从GATA%ACTGATTCTGACTGT^GAGATA^TGCACCCCGGACCATATTTATTAT蛆GTATGTAT从AGATAGCCAGCCTAGAGGTATGCCTGT从CT^TCTCTGTG从GTGTGAC从AATTTCAACTCTCrcCTGTGAG从C从^^TTATTTcCTTTA^GG从ATG从TCCTcCTGAT从CATc从GGATAC从从AGTGACATCATATTCTTTCAGAGA^GTG1℃C C A G G A C A T G A T ^ A T 从GATGC从TTTG从TCTTCATCATACGA^GGAT^CTTTCT^GCTTGTG^从^AGAGAGAGACCTTTTT从ACTCATTTTGAAAAAAGAGGATGAATTGGGGGATAGATCTATAATGTTCACTGTTCAAAACGAAGACTAG.Amp ^mD 罔3hIJJ8cDNA序列曲析 结果 Fi g

3 Nt t c l e o t i d e㈣ … e o f h i ] 【

8 g e n e 图4重组质粒 p B V2

2 0 一I】,1 8构建示意 图 F嘻

4 S t r a t ~ ~f [

1 T t ~ o ns t r u c d o t t o C r e ~ mhi a a nt p hs d p BV'

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20 - I L- 【

8 讨论1996年 , Us h i o S等【 用 鼠源 I G I F e DN A 为探针, 从正常人肝 细胞 e DNA文库分离到 了人IL一18eDNA克隆, 并在大肠杆菌中进行表达.研 究表明它广泛分布 于人体组织和细胞, 包 括肝 、 肾及活化的单核/ 巨噬细胞等, 同时发现未经处理和刺激 的枯氏细胞中也有 I L -

1 8 mR N A 一B一8~④ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 徐东刚等 : 人 白细胞介 索 一博 基因 的克隆 及其在大肠杆菌 中的表达 图5hII.18基 因在 DH

5 n中表 选的SD~P A GE 电司( 分析Fig5DS D― PAGE a n My ~s t h e r l f

1 8 p r ot e i n e x p ~s r , e d i a DH5 Ⅱ M P r o t e i n M a ~ e r l~ 2: p B V2

2 0 … f I l

8 i n DH5 C: Co n t r o l s t r a i n 的高表达, 而用 L P S处理后对表达量没有影响 已有越来越多的研 究表明细胞因子的作用 不是 独立 的,而是处在 一 个十分 复杂的网络 中.目前 对IL一18功 能 的研 究刚刚起 步,发现它的 生物 活性 与IL-12相似 , 对NK 细 胞具 有 明显的激 活作用,同时重 组人I[.-18具有 提高IFN・