PDF《T4 DNA Ligase》

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网址:www.yeasen.com 第1页,共2页HB181205 T4 DNA Ligase 产品信息 产品名称 产品编号 规格 T4 DNA Ligase 10301ES40

40000 U(40 KU) 产品描述 T4 DNA Ligase 在ATP 做辅酶的情况下可催化 dsDNA 平末端或粘性末端相邻核酸的 5'磷酸末端和 3'羟基末端形成磷酸 二酯键,还可催化 RNA 和双链中的 ssDNA 或RNA 链连接,但不能催化全单链核苷酸间的连接. 本品主要适用于标记 RNA 3'-末端,环化 RNA 和DNA 寡聚核苷酸以及克隆 cDNA 等核酸操作. 产品组分 组分编号 组分名称 规格 10301-A T4 DNA Ligase (400 U/?L)

100 ?L 10301-B 10* Ligase Buffer

1 mL 运输和保存方法 冰袋运输.-20℃保存. 单位定义 在20 μL 的连接反应体系中,6 μg 的λDNA-Hind Ⅲ 分解物在 16℃下反应

30 min 时,催化 50%以上的 DNA 片段发生连接 所需要的酶量定义为

1 个活性单位(U). 质量控制 核酸外切酶残留检测:2000 U 的本品和 0.6 μg λ-Hind III 在74℃下反应

1 小时,DNA 的电泳谱带不发生变化. 核酸内切酶残留检测:2000 U 的本品和 0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA 在74℃下反应

1 小时,DNA 电泳谱带不发生变化. 注意事项 1)Buffer 在融解时,如果出现少量沉淀属正常现象,请颠倒混匀后使用. 2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作. 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:400-6111-883 E-mail: order@yeasen.com 本产品仅作科研用途! 第2页,共2页使用方法 1. 在无菌微量离心管中配制以下反应体系: 组分 使用量 10* Ligase Buffer

1 ?L 插入片段 0.3 pmol 载体 DNA 0.03 pmol T4 DNA Ligase (400U/?L)

1 ?L ddH2O To

10 ?L 【注】 :1)插入片段与载体的摩尔比应在 3:1-10:1 之间. 2)平末端载体与 DNA 片段进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防发生自连接现象. 2. 16℃反应过夜;

3. 转化 1)将连接产物加入到

100 ?L 感受态细胞中(连接产物不应超过感受态细胞的 1/6) ,轻弹混匀,冰上孵育

30 min. 2)将离心管于 42℃,热激

90 sec(不要晃动) ,之后立刻置于冰水浴静置 2-3 min. 3)向离心管中加入

900 ?L LB 或SOC 培养基,37℃,150 rpm,振荡培养

45 min,该过程使菌体复苏,抗性基因表达. 4)

2500 g 离心

5 min, 吸去

900 ?L 上清, 用剩余培养基重悬菌体, 用无菌涂布棒将剩余菌体在正确抗性的平板上涂布均匀, 待菌液被平板吸收后,37℃倒置培养过夜. 【注】 : 如果使用超级感受态细胞 (转化效率>108 cfu/?g) , 可直接吸取 100-200 ?L37℃孵育后的菌液涂板, 剩余菌液可在 4℃ 保存,1 周内都可重新涂板.