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4 中国病毒学第11卷 用70%乙醇 冼一 次.悬浮在 T A E缓 冲液 (

4 0mmo l / LTr i s ―Ac , p H8 .

0 .2 mm, : t / LE r r r A) 中.再用 无水 玲 乙醇 沉 淀一 次.离心后 , 沉 淀用

7 O %乙醇 洗 一次后 , 溶于 无菌 T E(

1 0n u n ~/ LTr i s HC

1 . p H8.

0 .1 mmo l / LE DT A) 缓 冲液 中.定核酸浓 度,分装.置2O℃保存 备用 .

5 感 扁组 织 中依赣 RNA的RNA聚 合酶 的分离 和纯化播种在防虫 温室,自然光 照条 件下的黄 瓜 出苗后 . 用粗 提的CMV―B一1 制 备物 在黄 瓜子 叶的正 反两 面都 接种 ,

4 d后.采收黄 瓜子 叶.用于 分离 纯化 依帻RNA 的RNA聚合 酶.以下 所有 操 作都 在4℃ 下进 行.所有 的溶 液都 用DE P C处 理过 的无菌水 配制.所用器皿都洗 净、烘干 、 灭菌. 具体 操作 如下:50g黄 瓜子 叶.加100mL缓 冲浪 A(

5 0m o l t '

I . T r i s ―H C I . p H

7 .

4 .1

5 n , X , l O t / [ .Mg a2 ,

1 0 n u n ~/ LKC I t

2 0 %( v, V) 甘油,

0 .

1 %巯基 乙醇 .

1 , ~ mo l / Ll e t l l ~ t i n ,

1 ~n o l / L , a p r o t i n i n1 U mo l / I .p e p s t a t i n ,5

0 . u mo l / L a p r o t i n i n ) 及 少量 金钢 砂研 睹.研睹物3000g.4

1 2. 离心10r ai n . 上 清于

3 0

0 0

0 g .4℃ . 超速 离心30mi n . 沉淀溶 于6mL缓 冲液 B[

5 0mmo l / [ . T r i s ―H C

1 ,p H8 .

2 .1 0mmo l / I .MI ~1

2 .1 0m md / LD TT.5 %( v / V) 甘油.1~, L o l / I .1 e u p e p t i n ,1 , ~ m o l /

1 p e l ~t a t i n .5 0~, L o t / I . a p r o t i a i n ] .加10%( V / V)NI P 一4 0和750mmo l g I . KC I 至终 体积

1 OmL , 搅拌

3 0mi n . 于1001~0 g . 4℃, 超速 离心30mi n . 上 清液 补加5mL缓冲浪B,混匀后, 样 品液 于15~3

0 %甘油 线型 梯度 ( 用古0.5%NP一4 O和1∞mmo l / I .KC

1 的缓冲浪B配 翻).801~0 g . 2℃ 离心20h,分部 收集.每管14mL . . 测 每管 的酵 活. 收集 古酵 活的峰 . 装 在透 析袋 中 .对 D E ;

P C 处理 的 无菌 水透析48h.中问更换 一 次水 .透析物 经浓 缩后, 置一7 0℃ 冷冻 2~4d . 使酵 液呈 干粉 状.将其溶 于30%甘油 溶液中.于一2 O℃保存 备用在此条 件下, 数月 内酵活 不丧 失.

6 依赣RNA的RN A聚 合酶 活性 蔫定 依照 文献 【

6 . '

报道 的方法 , 稍加 修改 .2 5止, 反应 混 合物 【

1 旺mmo l / L M .5

0 r a mo l / LT r i s ―H C I . p H

8 .

2 ,1

0 % ( V / V) 甘油.10mmd/ L KC I .

2 5 n u n ~/ L ( N} I . )

2 S O, .

1 mmo

1 ] L N a

2 E D TA.4mmo l / LD TT. 各1mmo t / I . AT P . C T P .G TP . 2.

0 uc 户H―UT P.

2 0 0~ g / mL模板RN酵藏15I】.在反 应管 中.30℃ . 保温

1 .

5 h , 加入

2 5 ,

2 0 %三氯 乙酸 , 置冰 溶中311rai n后. 全部 点在 村有 D E一8 1滤 纸园 片的 抽滤 器中 . 用10%三氯 醋酸洗 6次.用无 承 乙醇洗 两次 . 每 次各 用10mL '

待撼纸 干后. 置 古有 闪烁渍 的瓶 中. 在液 闪仪 上测 定放 射性 计数 .

7 傩外合成 产物分斩5∞反应混合物[10n蚰LMg a2 .

5 0 n 蚰LTr i s Ha. p H

8 .

2 .

1 0 n ~ml / L K C

1 ,O .

4 2 mL放线菌素D.

2 5 n ~ml / L( N} I . )

2 s D . .1mme l / LE l Y r A.4mm L D TT ,2

1 1 u C i口一 P― ur P或口一P―GT P,

2 1

1 0删/ mL模板 RN A,3

5 0 , 酵液 . 各1n蚰L^TP , C T '

P和~- r P ] . 在 反应管 中.3O℃, 保温

1 h后.转移到 球浴 中,加入 等体积 的水饱 和酚一氯仿 (

1 :

1 V / V) . 抽提

1 0 mi n ,

1 2 O

0 0 r / r a i n . 4℃离心 . 沉 淀真 空干燥 后,溶于古双 指示 剂的变性 缓冲液(90%甲酰 胺,10%D E P C处理 过的水.0. 5*T B E ,

0 .

2 5 %嗅 酚兰 .

0 .

2 5 %~ - -甲苯兰 ) 中, 在古7t n

0 l / L尿素的5%寨 丙烯 酰胺 凝胶 中 电诛 分离.电诛 完毕 后,将胶爱泡在

1 0 % 甲醇 ,

1 0 %乙醇溶 液 中固定

3 0mi n , 取 出在 干胶 器中 将胶 干燥后 , 放在暗盒 中, 置一7 0℃

2 ~

1 5 d进行 放 射性 自显 影.结果与讨论

1 依赣RNA 的RN A 聚合酶的纯化爰酶活按照材料和方法中所述. 经100000g超离 心的样品溶液 在I5~3 0%等密 度甘油线型 梯 度离 心后, 分部收集, 每管 i . 4mL . 测定各分部的酶活性 . 在20%和

2 5%甘油浓度 处各 出现 一 个酶活性 峰, 称为峰 l ( P

1 ) 和峰 I I ( P

2 ) ( 见图

1 ) , 分别 收集两峰 的各管, 浓 缩后, 得到各 自的千 粉, 溶于30%甘油 中保存 在一2 0℃备用 .在此条件下保存 半年 酶活性 不丧失 .进 一步分析 用 此两峰的酶制 品在 体外 合成的产物 证明. P 2的酶活性 有模板特 异性. 能 合成 全长的CMV 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 杨 海花等 : 卫星RNA对 黄瓜 花 叶病毒 基 因组 R NA体外 合成 的影 响375dsRNA产物 . 而P1酶合 成的产物 主要是 小分子 片段 .因此 . 本实验 中所 用的是 P 2酶.Tu be nur n b叮3oi1矗20望10百O圈l甘油梯厦胃心后播性丹布F11)istfih u t l o n o fRNA ―d e p ( a m ~ a tRNA P d n目t 辩aetiviti~ a f t e r e e n t f if u g a d o a i n ,Ⅻ . l g r a d i e n t

2 卫星 RN A和黄瓜花叶病毒基 因组 R NA的体 外合成 比较 了P2酶 利用含卫星RNA 的CMV R NA 和不含卫星RNA 的CMV R NA 为模板的RN A合成效率 .反应混合钫 中除 四种底 物外, 以 n一 P―ur P或 a一 P―G TP作 产物 标记.反应产物 经酚 一氯仿 抽提 .

5 %变性 的聚丙烯 酰胺凝胶 电泳 分离, 胶干燥 后.放射性 自显 影.结果见图2.图2结 果说 明, P 2酶 能利 用 含卫 星RNA的CMV―I L NA和不含卫 星RNA 的CMV ― R NA为模 板, 合成全 长的卫 星RNA和CMV 基 因组 R NA, 产 物为 d s R NA.但用黄 瓜子 叶总RNA为模 板则没有任何 产物合 成,因此酶具 模板特 异性 , 既能 用CMV基 因组 RNA为模 板. 又能以卫 星RNA为模板合成相应 的产物.这 说明卫星 RNA和CMV基 因组 R NA s 是利 用同 一 酶系 来合 成的.从总的放射性掺 入来看, C MV―B基 因组 R NA s合 成最 强, 而CMV―B一1和CIWq―D 基因组 R NAs合成较 弱.从掺入到卫星 RN A及CMV基 因组 R NAs 各组份 中的放射性 看, 其 强弱程度不同, 以CMV―B―l R NA为模 板时, 几 乎有

5 0 %的放射 性掺入到 卫星RNA中, R NAI 、 R NA2和RNA 4有等 量的掺入 , 而RNA3掺入 量变化 不大 ;

当以 CMV―BR NA 为模板 时. 约有

6 o%放射性掺入到 RNAI 、 R NA2和约

2 0 %掺入 到RNA 4中, 掺入RNA3变化不 大;

当以 C MV―DR NA为模板时. 约40%放射性掺 入到RNA 4中,

2 0

9 6 掺 入到 RNAI和RNA2 比CMV―B大 为降低, R NA 3变化 不大. 上 述结 果说 明, 不含卫星RNA 的CMV ―B基因组RNA 的合成要高于含卫星RNA 的CMV―B一1和CMV―D基 因组 R NA合成;

引起病 状_ 致弱的CMV―B一1中的卫星RNA 合 成略高 于引起坏死 的CMV―D中的卫星 R NA合成 . 且前 者 明显抑 制CMV亚基因组 R NA4 合成 . 后者则 明显抑制 C MV基 因组 R NAI和RNA 2的合 成. 而增强 RNA4的合 成. 有关感 染CMV 的组 织 中病 毒特 异 的侬赖 RNA的RNA聚合酶的 研究已有 几个 报道 . Ha y e s等[8】成功 地分离和纯化到均 一的黄瓜花叶病 毒复制 酶, 证 明此酶 由CMV编码 的两个组 维普资讯 http://www.cqvip.com

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6 中国病毒学第11卷 图2卫星RNA对CMV 基因组dsRNA s台成的影响Fig2Ef fe c t o f CMV ―d a RNA s yn t h e ~ b y s a t dl i t e RNA 1: CM V ―B 一1RN As + a a t d~ i t e RNA

1 2: CM V ―B RNA s '

3: CM V ―D RNA s + t dl i t e RNA ―D 4: To t a l R NA s f r o m h e a l t hy c a e u mb e r o M―e d

0 ∞ 份和寄主编码的一个

5 0 k D蛋 白共同构成 .wu等_9从感染 CMV的烟 叶中分 离纯 化到 C MV 特异的依赣 R NA的RNA聚合酶, 证 明此酶 在体 外能合成卫星 R NAC A RNA

5 一L和一s , 但 不能合成同一病 毒组的花生矮化病 毒的卫 星RN A P AR NA5 , 且以同等 的合成效 率合 成CMV 基 因组 RNA s及其卫 星RNA.本研 究实验结果证 明, 从感染古卫星 RN A C MV的黄 瓜子 叶中 分 离纯 化到 的依赖 RNA的RN A聚合酶, 在体外能以 C MV 基 因组 RNAs 及其卫星 RNA为模 板 合成 全长 的相 应dsRNA, 这与Wu [ 的 结果 一致 .然 而实验 结果还说 明, 致弱卫星RNA ( C MV―B―1 ) 存在时, C MV基 因组 R NA合成 受 到抑制 , 尤其明显抑制 R NA4的 合成 , 而引起植物 坏死 的卫 星RNA( C MV―D) 存在时则增 强RNA4的合成 , 因此推测 卫星RNA可 能是 通过某种机制调节病 毒亚基 因组 R NA 4的合成 , R NA4含有外壳蛋 白基 因, 它 的抑制 或增 强影 响到外壳蛋 白合成 , 从而改变 C MV 引起的植物病状 . 参考文献1田被 . 张 秀华. 邱 并生等 一种 新时病 毒病防柏方 甚― ―甩 卫星 棱糖 棱馥 生物 防治 黄瓜 花叶病毒病 . 科学 通报.1986.6;

4792Po l i e n.Gu s u i W u .S ~t dl i t e RNA f or t h e b l o c o n t r d o f pl a n t d~e a s e. Ad v a n c e i n vi I 胛Re s e a r c h,

1 9

91 .

3 9:

32 1~3

39 3 康 良仪. 毋 答穗 . 绦求蝉 等带卫星 R NA黄 瓜花 叶病毒 保护接种 的植物病 毒积 累与基 因组 R N A音成 及病妆 表选 病毒 学报.1988.4(1):45~5

2 4 毋谷 穗. 康 良但. 田被 黄瓜 花 叶病毒 株系问 交置保 护作用与 卫星RNA干扰 作 用的 比较 研究精生物 学报,

1 9

8 9 .

2 9 (

5 ) ;

维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 杨海 花等 : 卫星RN A对黄 瓜花 叶病 毒基 因组 RN A体外 合 成的 影响

3 7

7 3 71~

3 7

7 5 毋各 暮. 康 良仪 . 母菠 用 A蛋 白夹层酸联 免疫 喂附珐对 黄瓜花 叶病 毒的直清擘 鉴定散生 物学报 .

1 9

8 8 .

2 s (

3 ) :

2 1

1 ~2 l

5 6 M D C I t I k c e JM .Tm y e B o w 嘲~irtlBRNA― r e #;

c a s ~ c o n t ai n s a l - d 一e n c o d e d s u hml t . V酞.I

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0 m , e f r o m c o w一~etal~v i r u s― i nf e c t e d ∞ p∞ l e a v e s , 、 r i I o ∞

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8 2. I

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9 8 Ha y e s R J . Ke n n e t hW B u c k .C o mp l e t e r e p l i c a f i o n o f e u k a r y ~i c v ~ - u s RNA n m b y a p ~ G e dRNA ―d q 瑚t蛐RN A p o 一me m s e .Ce i l .1

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6 The Ef f e c t o f Sa t e l l i t e RNAs o n Re pl i c a t i o n o f Cu c m b e r M o s ai c Vi r u s Ge no m i c RNAs i n v i t r o Ya n g Ha i h u a Ka n g Li a n g y i Z h a o D a i h ~ Ti e n Po ( I n s t i t u t e o fMi c r o b i o l o g y ,Gl I M ^

4 如ofS c i e n c e s ,B e i j i n g t o o o s o ) RNA ―d e p e n d e n t RNA p

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