PDF《DNA 合成原理概述》

1 DNA 合成原理概述 历史 寡核苷酸的化学合成起步于

20 世纪四十年代末.

1955 年, 剑桥大学的 Todd 实验室成功合成了具有磷酸二酯键结构的 TpT, 并获得

1957 年诺贝尔奖.

1965 年,Khorana 等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一聚合物或二种、三种脱氧 核苷的重复序列,以及人工合成的六十四种核糖三糖苷,研究蛋白质的生物合成过程,从而 确定了氨基酸的三联密码子,因此获得

1968 年诺贝尔奖. 六十至七十年代, 寡核苷酸的化学合成方法不断完善, 逐渐形成了今天被广泛应用的固 相亚磷酰胺三酯法并实现了合成的自动化. 八十年代中后期,随着 PCR 技术的广泛应用,化学合成的寡核苷酸几乎进入了每一个 分子生物学实验室,为PCR 这一分子生物学及医学工作者的利器提供了刀锋. 今天,世界上每天化学合成的寡核苷酸数以十万计,在HGP、基因治疗、基因芯片等 生物医学热点中有着广泛的应用. 基本原理 核酸分子的基本骨架是相邻核苷酸间的 3'

→5'

磷酸二酯键, 一个矛盾便是核苷酸为一个 多官能基团的分子, 且人工化学合成核酸分子必定是一个多步连续的反应, 因此要求副反应 尽可能的少, 否则目的产物的产率以及纯化的难度会使合成失败. 所以化学合成的基本过程 便是在合成过程中尽可能的将不需要的基团暂时保护起来, 在一轮偶联反应之后, 再将上一 轮基团上的保护基选择性的脱下来,以形成专一的磷酸二酯键. 固相亚磷酰胺三酯法 对此方法的最简单描述是:溶液中的单体通过偶联反应形成 3'

→5'

磷酸二酯键,从而连 接到固相支持物上.下面是较详尽的描述: ? 基本材料: 1. 支持物: 固相合成是将核酸固定在固相载体上完成合成反应的, 最常用的固相载体为可 控微孔玻璃珠(CPG,controlled pore glass) ,CPG 的孔径根据所合成的寡核苷酸的 长度而定,一般合成链长小于 60mer 时,选择孔径

500 埃CPG;

链长大于 60mer 时, 使用

1000 埃CPG. 使用 CPG 的偶联效率高达 98%-99.9%, 可以满足合成长达 175mer

2 的寡核苷酸的条件.CPG 通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合,核苷酸的 5'

羟基用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护. 2. 单体: 合成所用单体为核苷亚磷酰胺, 是经过化学修饰的核苷酸, 含下面几个功能基团: 1) 3'

位P上二异丙胺基,偶联所用的功能基 2) 3'

位P上腈乙基,保护基,合成完毕后脱去. 3) 5'

-DMT,保护基,偶联前脱去. 4) A 和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基,合成完毕后脱去. 5) G 上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基,合成完毕后脱去. ? 反应步骤: 1. 合成的第一步――去封闭(Deblocking) ,用三氯乙酸去除 CPG 所连核苷上的 DMT, 以暴露 5'

羟基,供下一步偶联.此步需要注意 TCA 为一较强的酸,可能会有脱嘌呤作 用,故TCA 与寡核苷酸接触时间不要超过规定时间. 2. 第二步――活化(Activation) ,在偶联之前,单体与四唑混合并进入合成柱,此时四唑 提供一个质子给 3'

磷酸上二异丙胺基的 N 原子,质子化的二异丙胺是一个良好的游离 基团,与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体.此步四唑过量保证了单体活化充分. 3. 第三步――偶联(Coupling) ,亚磷酰胺四唑与 CPG 所连的核苷酸碰撞时,与其 5'

羟 基发生亲核反应,发生偶联并脱掉四唑,合成的寡核苷酸链延长一个.此步单体相对于 CPG 所连核苷酸上 5'