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50 个循环. 5. Ct 值:在相同 PCR 反应条件下,使用 Super EvaGreen ? 和SYBR Green I 进行的 qPCR 反应, 其Ct 值相对误差在+1 或-1 之间. 6. 扩增片段长度: 为了使 Super EvaGreen ? Master Mix 的扩 增效率达到最佳,推荐的 DNA 扩增长度为 50-200 bp, 如果 需要扩增更长的 DNA 片段, 那么需要适当延长 PCR 的反应 时间. 7. 凝胶电泳分析 PCR 扩增产物:当使用 Super EvaGreen ? Master Mix 进行 PCR 扩增反应后, 如需进行 DNA 凝胶电泳 分析,只要在 PCR 反应溶液中加入 DNA loading buffer,按 常规程序上样, 跑电泳, 不需要在制胶时额外添加核酸染料. 使用

254 nm UV 激发器、 凝胶成像仪, 或SYBR Green 滤光 器可以直接观察凝胶. 另外, 凝胶也可以用 488nm 的激光 凝胶扫描仪进行观察.

二、PCR 反应体系 每管反应组分如下表所示: 1. cDNA 模板:Super EvaGreen ? Master Mix 适用于 mRNA 的定量分析.第一步通过逆转录将 mRNA 转录成 cDNA, 第二步利用 Super EvaGreen ? kit 进行 cDNA 的定量扩增. 为了确保扩增效率, cDNA 样品的体积不要超过总反应体积 的10%.为了精确定量转录水平,我们推荐使用 no-RT 的 对照样品,以排除可能的基因组 DNA 的污染. 2. 一步法 RT-qPCR 用于 mRNA 的定量分析. 首先引物设计 时要尽量避免形成引物二聚体. 我们建议合理优化逆转录酶 的使用量和逆转录过程的持续时间. 耐热的逆转录酶可以兼 容Agilent, Fermentas, Lucigen 和Life Technologies 等各种仪 器.如果可以,设计的引物 Tm 值尽量在 55℃左右,逆转 录及后续扩增反应也应在 55℃.为精确定量转录水平,我 们推荐使用 no-RT 的对照样品,以排除有可能的基因组 DNA 的污染. 3. 模板浓度:DNA 模板的添加量通常在

100 ng 以下.因 不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同, 必要 时可进行梯度稀释,确定合适的 DNA 模板添加量.cDNA 作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%. 4. 参照染料 ROX:对于某些固定型号的仪器,必须添加 ROX 才能精确测定 Ct 值. ROX 的使用浓度可以参照表

1 (见第

4 页) . ROX 会给熔解曲线分析造成一定的背景干扰. 因此,为了避免 ROX 杂峰干扰,在应用软件的 Passive Reference Dye 中不要选择检测 ROX 荧光值选项, 然后再进 行数据的收集与分析. 反应组分

20 μL 反应体系 终浓度 2* Fast Super EvaGreen ? Master Mix 10μ L 1* F, R 引物 * μL 各0.1-0.5 μM 模板 * μ L( 见注

1 &

2) 见注

3 10*ROX 适量 见注

4 &

表1H2O 补足至

20 μL

3 /

5 US EVERBRIGHT? INC. 技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com

三、反应程序设置 您可以根据扩增模板的性质和仪器的功能, 选择以下三个程 序之一进行实验. A.两步快速扩增法 这个程序适用于大多数引物 Tm 为60℃的扩增,溶解曲线 遵循您所用仪器提供的标准流程执行. 程序 温度 时间 循环 酶激活

95 ℃

2 min

1 变性 退火&

延伸

95 ℃

60 ℃

5 s( 见注 5)

30 s

45 注意事项 5. 变性时间:如果扩增片段较短,变性时间可以低于

5 s, 甚至可以低至

0 s.当变性时间设置为

0 时,它仅仅意味着 温度增加到

96 ℃,然后没有停留迅速降温.设置时间

5 s 可以确保 DNA 较长片段和高 GC 片段的变性.高性能的仪 器会进一步增加扩增子变性的可靠性. B . 三步扩增法 这个程序适用于扩增温度比退火温度高的实验. 例如, 如果扩增片段有相对较长的引物, 容易产生非特异性的扩增, 在更高的温度下进行延伸可以降低非特异性扩增. 溶解曲线 遵循您所用仪器提供的标准流程执行. 程序 温度 时间 循环 酶激活