PDF《中的应用》

收稿日期:2009-12-23 基金项目:国家质检总局科技计划项目(2009IK206) 作者简介:莫秋华(1973-),男,医学博士,副主任技师,主要从事传染病 防控研究,

电话:0756-8892423,E-mail:mpcr@yahoo.

cn;

李强(1974-), 男,医学硕士,主管技师,

电话:020-62787123,E-mail:liq@fimmu.com,莫 秋华和李 强为共同第一作者 通讯作者:杨泽,E-mail:zychfb@163.com% 食源致病菌

96 微孔板 DNA 诊断芯片的研制及在一起食物中毒突发事件 中的应用 莫秋华

1 ,李强2,林继灿

1 ,谭华1,涂承宁

1 ,叶立青

1 ,刘志明

1 ,杜坚1,孙 虹1,李书香

1 ,王献煌

3 ,杨泽1(1 珠 海出入境检验检疫局,广东 珠海 519020;

2 南方医科大学南方医院检验科,广东 广州 510515;

3 晶宇生物科技实 业股份有限公司,台湾 苗栗县 350) 摘要:目的 研制能同时检测

9 种常见食源致病菌的

96 微孔板 DNA 诊断芯片. 方法 针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、 大肠杆菌 O157:H7(Stx1 和Stx2)、志贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、 霍乱弧菌等

9 种最常见的食源性致病菌,首先选择合适的保守基因,设计种特异性的 PCR 引物(5'

端标记生物素)和检 测探针,通过参数优化建立一管多重 PCR 扩增体系;

然后按 5*5 的阵列格式将探针点制到

96 微孔板的微孔内,通过条 件优化建立稳定的PCR 产物与固化探针的微孔杂交体系;

采用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的 PCR 杂交产物. 结果

20 株标准菌株验证已建立的食源致病菌微孔板 DNA 诊断芯片,获 得比较特异和稳定的实验结果. 在一起食物中毒事件中,该芯片在采样后 12%h 内检出金黄色葡萄球菌,与传统的细菌 分离培养和生化鉴定的结果相符. 结论 本研究建立的新型食源致病菌

96 微孔板 DNA 诊断芯片具有快速、 准确、自 动化和高通量等特点,为快速应对食物中毒等突发公共卫生事件提供了非常有价值的检测技术. 关键词:食源致病菌;

96 微孔板芯片;

DNA 检测;

食物中毒 中图分类号:R378%%%%%%%%文献标识码:A%%%%%%%%文章编号:1673-4254(2010)03-0417-05% Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning MO%Qiu-Hua1 ,%LI%Qiang2 ,%LIN%Ji-Can1 ,%TAN%Hua1 ,%TU%Cheng-ning1 ,%YE%Li-qing1 ,%LIU%Zhi-ming1 ,%DU%Jian1 ,%SUN%Hong1 ,%LI%Shu-xiang1 ,% WANG%Sino3 ,%YANG%Ze1

1 Zhuhai%Entry-Exit%Inspection%and%Quarantine%Bureau, %Zhuhai%519020, %China;

%2 Department%of%Clinical%Laboratory, %Nanfang%Hospital,% Southern%Medical%University,%Guangzhou%510515,%China;

%3 DR.Chip%Biotechnology%Incorporation,%Miaoli%350,%Taiwan,%China% Abstract: Objective To%develop%a%96-microwell%plate%DNA%diagnostic%chip%for%simultaneous%detection%of%9%major%foodborne% bacteria. %Methods Type-specific%PCR%primers%labeled%with%biotin%and%oligonucleotide%probes%were%designed%according%to%the% conservative%genes%of%9%major%foodborne%bacteria%Staphylococcus aureus,%Salmonella spp.,%Escherichia coli O157:H7%(Stx1%and% Stx2), % Shigella spp., % Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, % Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus.%A%one-tube%multiplex%PCR%system%for%simultaneous%amplification%of%these%bacteria%was%established,%and%the% DNA%probes%were%spotted%and%immobilized%in%the%wells%of%the%plate%in%5*5%array%format. %Stable%hybridization%system%between% PCR% products% and% oligonucleotide% probes% in% the% microwell% was% established% after% condition% optimization. % Alkaline% phosphatase-conjugated% streptavidin% and% NBT/BCIP% were% used% to% detect% the% hybridized% PCR% products. % Results Twenty% standard%bacteria%strains%were%used%to%validate%the%96%microwell%plate%DNA%diagnostic%chip%and%highly%specific%and%stable% experiment%results%were%obtained.%Using%this%chip%assay,%the%causal%pathogen%Staphylococcus aureus was%identified%within%12%h% after%the%sampling%from%an%incident%of%food%poisoning, %and%the%result%was%consistent%with%that%obtained%using%conventional% bacterial%culture%and%biochemical%identification. %Conclusion The%novel%96%microwell%plate%DNA%diagnostic%chip%allows%rapid,% accurate,%automated%and%high-throughput%bacterial%detection%and%is%especially%valuable%for%quick%response%to%such%public%health% emergencies%as%food%poisoning.% Key words: foodborne%bacteria;