PDF《说明书》

Genloci pGK1.

2(EGFP+Puro) vector 说明书 Cat. No. GP0139 Protocol No. PT161214-6 出版日期 Dec.

2016 南京市汉中门大街

301 号 南京国际服务外包产业园

01 栋13 层A座

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2 III. 产品概要…3-4 IV. 操作步骤…5 1. 设计 Oligo DNA 序列…5 2. pGK1.2(EGFP+Puro) vector 线性化处理…6 3. T4 DNA Ligase 连接…6 4. 电转染靶细胞…6 5. Cruiser? 筛选阳性克隆…6 V.FAQ…7 VI. 附录…8 VII.参考文献…9 图Figure 1. CRISPR/Cas9 工作原理示意图 Figure 2. CRISPR/Cas9 基因编辑实验流程 Figure 3. pGK1.2(EGFP+Puro) vector 插入位点图示 Figure 4. pGK1.2(EGFP+Puro) vector 质粒图谱 Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector Protocol No. PT161214-6 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 2/9 I.规格与贮存条件 在收到货后,请您先瞬时离心后再置于-20℃保存,且避免污染;

Cat. No. 产品名称 规格 GP0139 pGK1.2(EGFP+Puro)

4 μg II.附加产品推荐 本试剂盒不包含以下所需试剂和仪器,您可以购买指定产品或购买替代产品进行实验. ? Genloci TNA 抽提试剂盒 (Cat.No.:GP0155,GP0156) ? Genloci Cruiser? 基因敲除检测试剂盒 (Cat.No.:GP0102,GP0103) ? Genloci Cruiser? Enzyme (Cat. No.:GP0104,GP0105,GP0106) ? Celetrix 细胞电转仪 (Cat.No.:GP7901) ? Cell Plaza? 单细胞培养板 (Cat.No.:GP5036) ? Annealing Buffer(10x) (Cat.No.:GP0124,GP0125) Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector Protocol No. PT161214-6 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 3/9 III.产品概要 Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector 是一款高效、精准的基因编辑载体,它是基于最新一代的人工 核酸内切酶 CRISPR/Cas9 而研发的,相对于传统敲除技术和 TALEN、ZFN 技术而言,其操作更加简便, 敲除效率最高,基因的编辑更加的精准,大大降低了脱靶机率.Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector 试剂 盒能够适用于几乎所有哺乳动物细胞的基因修饰研究. Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector 包含

2 个重要组件,分别为 Cas9 核酸酶表达框和 Guide RNA(gRNA)克隆框,gRNA 克隆框能够快速高效的克隆编码靶标特异的 CRISPR RNA(crRNA)的DNA 片段.该载体能够让您仅靠单个载体就可以轻松地完成基因组 DNA 的编辑,实现精准、低off-target 的基因 编辑体验. Genloci 公司为您提供完整的基因敲除解决方案, 从敲除方案设计→敲除位点设计→载体构建→转染→ 敲除检测→结果分析,让您的实验一次成功! 产品特点精准的修饰 Cas9 蛋白无特异性,降低脱靶效应,实现精准的基因编辑 敲除效率高 较传统技术和 TALEN、ZFN 技术,敲除效率最高;

CRISPR/Cas9 系统的两大功能组件于一个载体上,转染效率更高. Figure1. CRISPR/Cas9 工作原理示意图 Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector Protocol No. PT161214-6 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 4/9 CRISPR/Cas9 基因编辑实验流程图如下: Figure 2. CRISPR/Cas9 基因编辑实验流程 pGK1.2 设计

2 条单链 oligo 序列;

退 火形成双链 DNA. 将双链 DNA 连接到敲除载体 中. 转化大肠杆菌细胞;

筛选阳性 克隆;

测序验证序列;

质粒大 提;

电转染靶细胞. 在细胞内 crRNA 识别靶位点, Cas9 对靶位点进行随机剪切. Cruiser? 酶切细胞池, 计算突变率;

Cruiser? 酶切初筛阳性克隆;

将阳 性克隆测序验证;

做敲除序列比对 分析. U6 CACCG CAAA

1 2

3 4

5 5'

-5'

3'

-3'

- - ~20bp Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector Protocol No. PT161214-6 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 5/9 IV. 操作步骤 实验前,请您务必做好以下验证实验: A.单细胞生长情况,确保单个细胞可以正常生长形成单克隆,即,低密度的细胞在培养皿中可以 形成单克隆. B.目的基因的表达情况分析,为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失,首先需要 PCR 扩增 靶基因,并对 PCR 结果进行测序,确保靶基因的完整存在;

其次,您还可以用 RT-PCR 分析 靶基因的活跃度. 1. 设计 Oligo DNA 序列 首先,您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA,您可以通过以下在线工具设计: 麻省理工学院的 CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/ 德国癌症研究中心的 E-Crisp:www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html 下面我们选择麻省理工学院的 CRISPR Design 工具来做设计举例,以human Fut8 基因为例,一次只 能输入大小为 23~250bp 的基因片段,最好一次只输入一个外显子,避免 Guide 序列跨内含子的. 点击 Download as genbank 按钮,出现以下界面: 根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列,score 的高低并不代表敲除效率的高低, 所以为提高 敲除的成功率,一般选择 2~3 个Guide 序列,构建 2~3 个敲除载体.后续先在 pool 细胞的基础上验证出 有效的位点,再拿此位点做正式电转,筛选单克隆.以Guide#1 序列为例,2 条单链 oligo 的序列如下(小 写字体部分是要分别与 BbsI 或BpiI 酶切后的载体相互补的部分) : Fut8-F: caccGAATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC 注意:设计 oligo DNA 序列时 Guide 序列第一个碱基必须是 G,如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G,应自行加 一个 G 上去,相应的下游引物序列互补的位置为 C(如绿色标注碱基 G/C) . Genloci pGK1.2(EGFP+Puro) vector Protocol No. PT161214-6 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 6/9 另外, 需在位点上下游各设计一条引物, 用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆, 引物能扩增约 300-500bp 的DNA 片段,上下游引物距突变位点约 100-400bp. 将设计后的序列送到值得信赖的公司合成,纯化级别为 PAGE. 2. pGK1.2(EGFP+Puro) vector 线性化处理 BbsI 或BpiI 单酶切 pGK1.2(EGFP+Puro) vector,胶回收约 10kb 的条带. 3. T4 DNA Ligase 连接 将合成后的

2 条单链 oligo DNA 稀释成

10 μM,先变性再退火形成 dsDNA,后与载体连接,反应体系 如下: 正链 Oligo(10μM) 5μl 负链 Oligo(10μM) 5μl ddH2O 8μl Annealing Buffer(10x) 2μl Total Volume 20μl 将以上体系瞬时离心后,置于 PCR 仪中 95℃孵育 3min,孵育后自然冷却 20min.进行 DNA Ligase 连 接反应,10μl 反应体系载体的添加量为 40ng,杂交后的 dsDNA 添加量为 1μl. 连接产物可以直接转化大肠杆菌高效感受态细胞,转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克 隆实验指南》 ,pGK1.1 的抗性为卡那霉素抗性,使用上游引物 VSP primer(Tm=56.7℃)与下游负链 Oligo 引物进行菌落 PCR 筛选,阳性克隆 PCR 正确大小应为

100 bp,筛选到阳性克隆后,需使用 VSP primer 测序验证序列的正确性. 注意:VSP Primer:5'

-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3'

(本试剂盒中不提供,请自行合成) . 4. 电转染靶细胞(推荐) 转染前进行质粒大提(去内毒素) ,确保质粒浓度≥1μg/μl 浓度,再按照转染仪器或转染试剂说明书取 合适的量进行转染操作,推荐使用 Celetrix 细胞电转仪(型号:CTX-1500A),贴壁细胞需 3x106 ~5x106 数量,悬浮细胞需 5x106 ~8x106 数量,转染体积 120μl,需质粒量 6-8μg. 5. Cruiser? 筛选阳性克隆 将靶 pool 细胞经过有限或梯度稀释后,在96 孔板中进行单克隆培养,如果靶细胞是悬浮细胞,推荐 使用 Cell Plaza? (Cat.No.: GP5036)培养细胞,待96 孔板长至

10 倍镜下视野 1/4 面积时,可转移至

48 孔 板扩大培养,待48 孔板长满后,可取

48 孔板一半的细胞提基因组,推荐使用 Genloci TNA 抽提试剂盒 (Cat.No.: GP0155,GP0156).然后通过 PCR 和核酸内切酶初步筛选阳性克隆,推荐使用 Genloci Cruiser? Enzyme ( Cat. No.:GP0104,GP0105,GP0106 ) 或Genloci Cruiser? 基因敲除检测试剂盒(Cat.No.:GP0102,GP0103)或Genloci Ex-Cruiser 基因敲除检测试剂盒(Cat. No.:GP0402, GP0403) ,对Cruiser 筛选后的阳性克隆进........