PDF《备与特异重结合性能研究》

5 3.2.2 水油比影响 PVPK90 能与水互溶,其溶液粘度与浓度相关,而粘度大小直接影响成球效 果.当油水比为 2:1 时,制得的微球粒径太大,不够均匀,形状不规整,比表 面积小,影响微球的重结合量和稳定性.水油比在 4:1 时,微球粒径在 100-300 μm 之间,粒径分布均匀,且比表面积有了很大提高,可以有效提高蛋白质的吸 附量,但微球产率下降,所以水油比在 2:1~4:1 比较合适.影响微球制备的因素 还很多如温度控制、反应时间等. a. ratio of water and oil 2:1 b. ratio of water and oil 4:1 Fig.3 Optical micrograph of the MIPMs in wet form prepared with different ratio of oil to water 3.3 洗脱过程与洗脱液选择 图4为印迹 PVP/CA 聚合物微球经过不同的洗脱液洗脱后,做重结合试验, 测其在 278nm 出的吸光度,通过计算绘成的重结合量随时间变化曲线.由洗脱 过程的观察中, 可以看出三种洗脱液的洗脱效果. 在洗脱过程中用 Tris 洗脱的微 球颜色较其他三种变深,而用 SDS 洗脱时,上清液会变混浊,原因是 SDS 和蛋 白质发生作用. 而Tris 洗脱的微球重结合效果最差, 可能是因为洗脱液中含有氯 化钙,在洗脱过程中蛋白质可能还没有被洗脱出来,就会被氯化钙的对微球的强 化交联作用封闭在里面了,微球内部的空穴也可能部分被封闭起来.所以最后选 择SDS 作为本实验洗脱液. 3.4 影响 BSA-MIPMs 印迹效率及其重结合性能的因素 3.4.1 重结合动力学 图5,图6为动力学重结合曲线,它反映了重结合容量 Q(这里定义为某一 http://www.paper.edu.cn

6 时刻的重结合量)和印迹效率 IE 随着时间 t 而变化的关系. Fig.4 Curves of Qe of H2O,SDS,Tris as a function of Rebinding time pH=6.3, Temperature:25℃, BSA: 20μmol/L

0 20

40 60

80 100

0 5

10 15

20 25

30 Q e ( ? mol/g ) *10 -3 Rebinding time(min) BSA-IMPs(1) NIMPs(2) Fig.5 Curves of Q as a function of Rebinding time pH=6.3, Temperature :25℃, BSA: 20μmol/L 本研究中影响重结合速率的主要原因可能是蛋白质在凝胶内部的传质[20-24] . 在 重结合开始时,BSA 分子容易达到凝胶微球的表面印迹孔穴,结合速率很快. 随着重结合量的增加,表面印迹孔穴不断减少,凝胶微球对迁移到其附近的蛋白 质分子的重结合的数量也相应减少,重结合速率开始下降.此后 BSA 开始向深 层印迹孔穴扩散,由于蛋白质分子具有很大的体积,所以在扩散过程中遇到很大 的阻力而导致重结合速率迅速下降.

0 20

40 60

80 100 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Q e ( ? mol/g ) Rebinding time(min) H2O MIPMs(1) SDS MIPMs(2) Tris MIPMs(3) http://www.paper.edu.cn

7 0

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5 Imprinting efficiency ( IE ) Rebinding time(min) Fig.6 Curves of Imprinting efficiency (IE) as a function of Rebinding time pH=6.3, Temperature :25℃, BSA: 20μmol/L 微球中的印迹孔穴和位点形状上与蛋白质互补, 可以使蛋白质分子与基材紧 密接触,由静电力和氢键等形成较强的结合作用,因此 BSA 更容易更快的固定 在印迹微球上.对非印迹微球来说,尽管在基材和蛋白质之间也能形成一些相互 作用,比如氢键,但是没有产生足够的印迹位点来与蛋白质分子形成强的结合. 蛋白质分子与非印迹微球之间的相互作用不如与印迹微球之间的那么强, 即使蛋 白质分子进入凝胶的网络内部,也不容易被固定在基材上,即使是固定在基材上 的蛋白质分子,也容易受环境的影响而脱重结合.因此与印迹微球相比,非印迹 微球重结合速率较慢,重结合需要的时间长. 3.4.2 BSA 浓度 (1)重结合前期底物 BSA 浓度对重结合容量影响 图7为重结合容量(10 分钟时)随BSA 加入量变化曲线,而在制备微球过程 中BSA 浓度都是 20μmol/L, 可以看出随 BSA 加入量的增加重结合量先........