DOC《生物实验室常用实验方法》

25 mM MgCl2 10?l

10 mM dNTP mix 5?l RNase Inhibitor (40 U/?l) 1?l AMV-Optimized Taq 1?l AMV RTase XL (5 U/?l) 1?l 上游特异Primer (20 ?M) 1?l 下游特异Primer (20 ?M) 1?l 实验样品RNA(≤1 ?g Total RNA) 1?l RNase Free dH2O 24?l Total 50?l /Sample 反应总体积根据实际情况进行调控,可以做20~50?l以节约试剂;

将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中;

如果不用PCR仪的加热盖,在反应混合液的上层加30 ~50?l 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发;

按以下条件进行反应 Step Temperature, °C Time, min Number of cycles Note 逆转录

50 30

1 逆转录酶失活

94 2

1 变性

94 0.5 25-35 退火 37-65 0.5 退火温度比理论退火温度大概低5°C,再根据反应结果优化 延伸

72 根据扩增产物的大小 Taq酶每分钟延伸1000bp 最终延伸

72 10

1 反应结束后,抽取扩增样品5?l,用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存,以备以后分析使用. 琼脂糖核酸电泳 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净,放在制胶平板上,封闭模具边缘,架好梳子;

根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液(一般20~30 ml);

放入到微波炉内加热熔化.冷却片刻,加入一滴荧光染料,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固;

室温下30~45分钟后凝胶完全凝结,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;

向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去;

在DNA样品中加入10*体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;

接通电源,红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负).一般60~100V电压,电泳20~40min即可;

根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;

电泳完毕,关上电源,在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小. 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围(bp) 0.5% 1,000~30,000 0.7% 800~12,000 1.0% 500~10,000 1.2% 400~7,000 1.5% 200~3,000 2.0% 50~2,000 胶回收纯化DNA 琼脂糖电泳,将特异电泳带用刀切下放入到EP管中,称琼脂糖带的重量;

按照每100mg加400?l的量加入binding buffer,放入到EP管振荡器中,45℃~55℃温育振荡,直到所有的琼脂糖都溶解(大概要5分钟);

取出纯化柱,将上述溶解液转移至柱中,室温下放置2分钟,8,000rpm 离心1分钟,弃EP管中的液体,将纯化柱放回EP管中;

加500?l的wash buffer至柱中,8,000rpm 离心1分钟.弃管中的溶液;

重复操作4步的操作1次,最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒,除去痕量的wash buffer;

将纯化柱放入一个新的EP管.加30~40?l H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央,在37℃或50℃下放置2分钟,10,000rpm离心1分钟洗脱DNA,将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存. 注:若想要不电泳而直接纯化DNA溶液,只需要在第2步中按100?l液量加400?l的binding buffer,其余的步骤不变. 大肠杆菌质粒DNA的提取(碱裂解法) 此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增. 取1.5ml细菌培养物于EP管中,4000rpm离心1分钟,弃上清液,使细菌沉淀尽量干燥;