PDF《生物质与生物能源实验室》

生物质与生物能源实验室 常用试剂配方手册

2013 年7月制 感谢夏涛、王艳婷、邹维华、陈鹏、丰胜求、王令强等老师 对本手册的编制工作,提出宝贵的意见.

使用过程中,如发 现有任何不足和需要增补的内容,欢迎老师和同学们反馈在 后附备页上,作为日后修订的重要依据. 主编:李丰成 编委:李英 黄江锋 李傲 万灿 冯永清 熊科 胡振 董舒超 目录一.DNA 提取.1 CTAB (1.5X)1 0.5 M EDTA (pH 8.0) 贮存液.1

1 M Tris・HCl (pH 8.0) 贮存液

1 氯仿:异戊醇 (v:v=24:1)1 75% 乙醇溶液

1 二.RNA 提取.2

3 M NaAc (pH 5.2)2 75% 乙醇溶液

2 三.大肠杆菌操作

3 LB 培养基

3 低盐 LB 培养基

3 溶液 I

3 溶液 II.3 溶液 III.4 0.1 M CaCl2 溶液.4

2 M MgCl2 溶液.4 SOB 培养基.4 SOC 培养基.5 四.酵母操作

6 YPD 培养基(液体)6 YPD 培养基(平板)6 YPDA 培养基(液体)6 YPDS+Agar.7 溶壁酶(蜗牛酶、纤维素酶 R-10)反应缓冲液.7 0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.0)7 酵母破碎缓冲液.7

100 mM PMSF.8 酚/氯仿(Tris 饱和酚配制)8 1.0 M LiAc.8 五.常用抗生素

9 六.分子标记

10 6%丙烯酰胺胶液

10 5*TBE.10 0.5 M EDTA

11 10% AP.11 硅化剂.11 染色液.11 显影液.12 Loading Buffer.12 七.蛋白常用试剂

13 PBS (pH 7.4)13

50 mM Tris HCl (pH 8.0)13 0.5M NaCl (pH 8.0)13

100 mM 醋酸钠.13

10 mM 还原型谷胱甘肽.13 5*SDS Loading buffer.14 30%丙烯酰胺母

14 10% AP.14 10% SDS.15 1.5 M Tris (pH 8.8)15 1.5 M Tris (pH 6.8)15 5*Tris-Gly Buffer.15 染色液.15 脱色液.16 转膜 Buffer.16 10*TBS 缓冲液.16 TTBS 缓冲液.16 封闭液.16 DAB/NiCl 显色液

17 一抗.17 二抗.17 八.纤维素合成

18 50 mM Mops buffer.18 蛋白酶抑制剂.18 去污剂.18 九.组织培养

19 N6max 母液 (10X)19 N6min 母液 (100X)19 Fe2EDTA 贮存液 (100X)19 Vitamin 贮存液 (100X)20 MSmax 母液 (10X)20 MSmin 母液 (100X)20 2,4-D 贮存液 (1 mg/ml)21 6-BA 贮存液 (1 mg/ml)21 NAA 贮存液 (1 mg/ml)21 IAA 贮存液 (1 mg/ml)21 KT 贮存液 (1 mg/ml)21 AS 贮存液 (0.002 M)22

1 M KOH 贮存液

22 CN 贮存液 (50 mg/ml)22 HN 贮存液 (50 mg/ml)22 Cef 贮存液 (100 mg/ml)22 HgCl2 (10 mg/ml) (10X) 贮存液

22 十.组织染色

23 木质素染色.23 胼胝质染色.23 纤维素染色.23 十一. 细胞壁成分测定

24 0.5 M 磷酸 buffer (pH 7.0)24 氯仿-甲醇 (100 ml)24 DMSO-H2O.24 0.5% 草酸铵

24 4 M KOH

24 乙酸-硝酸-水(8:1:2)25 H2SO4-蒽酮.25 A 试剂(苔黑酚)25 B 试剂(FeCl3)25 67% (v/v) H2SO4-72% (w/w) H2SO4.25 2.88% (w/w) H2SO4

25 苯-乙醇

26 Na2B4O7-H2SO4

26 间羟基联苯溶液.26 2% (w/v) NaHCO3

26 1 mM EDTA

26 十二. 半纤维素单糖测定

27 0.5 M 磷酸 buffer (pH 7.0)27 氯仿-甲醇

27 IS.27 10% NaHB4.27 十三. 木质素单体测定

28 苯-乙醇

28 2 M NaOH.28 乙基香兰素内标.28 二氯甲烷-乙酸乙酯

28 6 M HCl

28 流动相.28 十四. 纤维素 DP 测定.29

1 M 铜乙二胺溶液的制备.29 十五. 细胞壁降解转化

30 醋酸 buffer (pH 4.8)30 2% NaOH.30 1%(v/v)H2SO4

30 3.2 g/L 纤维素复合酶液.30 十六. 糖醇转化

31 磷酸 buffer (pH 4.8)31 5% K2Cr2O7

31 十七. 拟南芥消毒、种植

32 次氯酸钠消毒水.32 MS 培养基(固体)32 MS 培养基(液体)32 1/2 MS 培养基(固体)33 1/2 MS 培养基(液体)33 注:[ ]为分子量.

1 一.DNA 提取 CTAB (1.5X) CTAB 十六烷基三甲基溴化铵……………15 g

1 M Tris・HCl (pH 8.0)75 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)30 ml NaCl [58.5]61.4 g 单蒸水定容至1L,室温保存. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 贮存液 Na2EDTA ・2H2O [372.24]……………186.1 g NaOH [40]20 g ddH2O [18]800 ml 调节pH至8.0,单蒸水定容至1L.

1 M Tris・HCl (pH 8.0) 贮存液 Tris Base…121.1 g 浓HCl…42 ml ddH2O…800 ml 调节pH至8.0,单蒸水定容至1L. 氯仿:异戊醇 (v:v=24:1) 配制100 ml 溶液,氯仿96 ml,异戊醇4 ml. 75% 乙醇溶液 无水乙醇:ddH2O(v/v)=3:1,终浓度为75%.

2 二.RNA 提取

3 M NaAc (pH 5.2) NaAc [82.08]24.624 g 冰醋酸调节pH至5.2, DEPC处理过的双蒸水定容至100 ml. 75% 乙醇溶液 无水乙醇:ddH2O(v/v)=3:1,终浓度为75%. 采用DEPC处理过的双蒸水配制.

3 三.大肠杆菌操作 LB 培养基 NaCl [58.5]10 g 蛋白胨…10 g 酵母提取物…5 g 单蒸水定容至

1 L,固体添加

15 g 琼脂. 121o C 灭菌

20 分钟,冷到 55o C 左右,加抗生素. 低盐 LB 培养基 (用于 Zeocin 抗生素) NaCl [58]5 g 蛋白胨…10 g 酵母提取物…5 g 单蒸水定容至

1 L,固体添加 1.5%琼脂. 121o C 灭菌

20 分钟,冷到 55o C 左右,加抗生素 Zeocin,避光 4o C 保存. 溶液 I 葡萄糖 Glucose・H2O [198] ……………0.99 g 0.5 M EDTA (pH 8.0)2 mL

1 M Tris (pH 8.0)2.5 mL 单蒸水定容至

100 mL,高压灭菌 4o C 保存. 溶液 II NaOH [40]0.80 g SDS [288]1.0 g 单蒸水至

100 mL,4℃保存.

4 溶液 III 乙酸钾 [98]29.4 g 冰醋酸 [60]11.5 mL 单蒸水定容至

100 mL,4℃保存. 0.1 M CaCl2 溶液 CaCl2・2H2O [147]1.47 g ddH2O 定容至

100 mL. 注意事项: ? 灭菌后 4o C 预冷,新鲜配制使用.

2 M MgCl2 溶液 MgCl2 [95]19 g 单蒸水定容至

100 mL,灭菌

20 min. SOB 培养基 1) 蛋白胨

20 g 酵母提取物…5 g NaCl [58.5]0.5 g 加入

950 mL 单蒸水,玻璃棒搅拌至完全溶解. 2) 加10 mL

250 mM KCl 溶液, KCl [74.5]1.86 g 单蒸水定容至

100 mL. 3)

5 M NaOH 调pH 值至 7.0,单蒸水定容至

1 L,灭菌

20 min;

NaOH [40]2 g 单蒸水定容至

10 mL. 4) 使用前,加入

5 mL 灭菌的

2 M MgCl2.

5 SOC 培养基 1)

1 M 葡萄糖溶液: 葡萄糖 Glucose・H2O [198]………………19.8 g 加单蒸水定容至

100 mL,用0.22 μm 滤膜过滤除菌. 2) 向100 mL SOB 培养基中加入除菌的

1 M 的葡萄糖溶液

2 mL,混匀. 3) 配好后分装,1 mL 每管,用封口膜封好,-20℃ 保存.

6 四.酵母操作 YPD 培养基(液体) 酵母提取物…10 g 蛋白胨…20 g 溶解在单蒸水

900 ml 中,35 分钟液体灭菌(liquid cycle)后, 加100 ml 灭过菌的浓度为 20%的右旋葡萄糖(Dextrose). YPD 培养基(平板) 酵母提取物…10 g 蛋白胨…20 g (制备平板,再加

20 g 琼脂 Agar) 溶解在单蒸水

900 ml 中,35 分钟液体灭菌(liquid cycle)后, 加100 ml 灭过菌的浓度为 20%的右旋葡萄糖(Dextrose). YPDA 培养基(液体) 酵母提取物…10 g 蛋白胨…20 g 腺嘌呤 [135]0.03 g 溶解在单蒸水

900 ml 中,35 分钟液体灭菌(liquid cycle)后, 加100 ml 灭过菌的浓度为 20%的右旋葡萄糖(Dextrose).

7 YPDS+Agar 酵母提取物…10 g 蛋白胨…20 g 山梨醇(Sorbitol)………………182.2 g (制备平板,再加

20 g 琼脂 Agar) 溶解在单蒸水

900 ml 中,35 分钟液体灭菌(liquid cycle)后, 加100 ml 灭过菌的浓度为 20%的右旋葡萄糖(Dextrose), 冷却后,加抗生素. 溶壁酶(蜗牛酶、纤维素酶 R-10)反应缓冲液 山梨醇 [182]21.84 g 加0.1 M 磷酸缓冲液定容至

100 mL. 0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.0) 1) Na2HPO4

577 mL 0.1 M Na2HPO4・12H2O [358]…………………20.665 g 溶于单蒸水定容至 1L 2) NaH2PO4

423 mL 0.1 M NaH2PO4・2H2O [156]6.599 g 溶于单蒸水定容至

1 L. 3) 混匀. 酵母破碎缓冲液 Na2EDTA・2H2O [372.24]…………0.186 g DTT [154]0.077 g 甘油

50 mL PMSF

10 mL

100 mM (现用现加). 加入 0.1 M 磷酸缓冲液定容至

1 L.

8 100 mM PMSF PMSF (Sigma, p7626) [174]……………0.1742 g 加入

10 mL 异丙醇,-20o C 保存. 酚/氯仿(Tris 饱和酚配制) Tris 饱和酚…40 mL 氯仿 [119]40 mL Tris 缓冲液…20 mL 注意事项: ? 使用前需确认购买的 Tris 饱和酚是黄色,如已经变为红色则不可用;

? 先将 Tris 饱和酚和氯仿混合后再加 Tris 缓冲液液封;

? 充分混匀后 4o C 静置过夜方可使用,4o C 保存. 1.0 M LiAc LiAc [66]6.5990 g 加灭菌单蒸水定容至

100 mL,用0.22 μm 滤膜过滤除菌.

9 五.常用抗生素 母液浓度 工作浓度 溶剂 储藏温度 备注 Amp

100 mg/mL

100 ug/ml ddH2O 4o C 过滤灭菌 Kan

50 mg/mL

50 ug/ml ddH2O 4o C 过滤灭菌 Spec

100 mg/mL

100 ug/ml 甲醇 4o C 无需灭菌 Rif

50 mg/mL

50 ug/mL DMSO 4o C 过滤灭菌

10 六.分子标记 6%丙烯酰胺胶液 尿素 [60.06]840 g 丙烯酰胺 [71.8]114 g 甲叉-丙烯酰胺 [154.2]6 g 5*TBE 缓冲液…200 mL 单蒸水定容至

2 L. 注意事项: ? 穿带实验服、口罩、手套,避免污染和中毒;

? 磁力搅拌器搅拌至清澈;

? 使用前用双层滤纸过滤;

? 4o C 保存. 5*TBE Tris-base [111]54 g H3BO3 [61.83]27.5 g 0.5M EDTA (pH 8.0)20 mL 单蒸水定容至

1 L 注意事项: ? 可用温水加速溶剂溶解;

? 室温保存.

11 0.5 M EDTA Na2EDTA・2H2O [372.24]……………93.06 g NaOH [40]10 g 单蒸水定容至

500 mL. 注意事项: ? 调pH 为8.0;

? 高温高压灭菌后,室温保存. 10% AP AP [228]4 g 单蒸水定容至

40 mL, 放久易失效. 注意事项: ? 溶解后保存在 4o C. 硅化剂 氯仿或无水乙醇……………………500 mL 二氯二甲基硅烷……………………25 mL 总体积

525 mL 注意事项: ? 摇床上摇匀过夜;

? 室温保存. 染色液 硝酸银 [170]2 g 单蒸水定容至

2 L. 注意事项: ? 避光保存.

12 显影液 NaOH [40]30 g 无水 Na2CO3 [106]0.6 g 单蒸水定容至

2 L. 注意事项: ? 使用前降温至 4o C 使用. Loading Buffer 0.5 M EDTA (pH 8.0) ………………1 mL 溴酚蓝…0.1 g 二甲苯菁…0.1 g 去离子甲酰胺定容至

50 mL 注意事项: ? 配制时先精确称量溴酚蓝和二甲苯菁,转入

50 mL 容量瓶中,再加入 0.5 M EDTA,用去离子甲酰胺定容至

50 mL;

? 在通风橱中进行.

13 七.蛋白常用试剂 PBS (pH 7.4) NaCl [58.5]40 g KCl [74.5]1 g KH2PO4 [136.09]1.2 g Na2HPO4・12H2O [358.14]……………18.1 g 单蒸水定容至

5 L.

50 mM Tris HCl (pH 8.0) Tris [121.14]6.055 g 溶于 900ml 单蒸水中,用HCl 调pH 到8.0 后定容至

1 L. 0.5M NaCl (pH 8.0) NaCl [58.5]29.25 g 溶于

900 ml 水中,用NaOH 调pH 到8.0 后定容至

1 L.

100 mM 醋酸钠 醋酸钠 [82.03]8.2 g 溶于

1 L 单蒸水中.

10 mM 还原型谷胱甘肽 还原性谷胱甘肽 [307.32]……………0.15366 g 溶于

50 ml

50 mM Tris-HCl (pH 8.0)中.

14 5*SDS Loadi........