PDF《在线净化 LC-MS/MS》

热点聚焦Hotspot 在线净化 LC-MS/MS 系统对动物组织中克伦特罗残留的检测分析 赵孔祥

1 王海鉴

2 1.

天津出入境检验检疫局食检中心 ;

2. 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 克伦特罗俗称瘦肉精,常被用作饲料添加剂以提高家 畜的瘦肉含量,但由于其严重的毒副作用,欧盟于

1988 年1月1日起禁止盐酸克伦特罗物质当饲料添加剂使用.

1991 年被 FDA 禁止.1997 年,中华人民共和国农业部下 文严禁 β- 肾上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用,盐酸 克伦特罗列为第一位.2009 年7月为应对日、韩从我国食 品中检出盐酸克伦特罗事件,质检系统确定了了更严格的 出口判定标准 (0.05?g/kg), 食品检测已经进入超痕量时代. 在此背景下,我们需要更有效的前处理手段以便我们 得到更加浓缩更加纯净的样品来提高我们的信号降低我 们的噪音.基于色谱原理的创新样品制备方法――Turbo Flow 技术为我们提供了新的思路.这种在线自动过程处理 技术结合了扩散、化学和体积排除的原理,在捕获感兴趣 分析物的同时,快速消除基质干扰.本实验旨在建立一个 前处理简单,选择性灵敏度高的克伦特罗的 Turbo Flow 实 用在线净化方法,并确定该方法的检出限.

1 实验部分 1.1 样品制备 取5g 动物组织样品与 10mL 乙腈,10% 乙酸铵 (1:3) 混合溶液混匀匀浆

10 分钟,5000r/min 离心十分钟取 1mL 上清液经过 0.22?m 注射过膜,上机. 1.2 Turbo Flow 条件 系统: Thermo Scienti?c Aria TLX-1 controlled by Aria? software 在线净化柱: Turbo Flow Cyclone MCX 0.5*50mm 进样体积: 50?L 上样溶剂: 0.1% 的甲酸水溶剂 上样流速: 2mL/min 洗脱溶剂: 1%的氨水甲醇溶液 洗脱体积: 50?L 1.3 HPLC 方法条件 色谱柱 : Hypersil GOLD aQ 3?m

100 X 2.1mm 流路 A : 0.1% 的甲酸水溶液 流路 B : 甲醇 时间(min) A% B% 流速mL/min

0 90

10 0.4

1 90

10 0.4 2.33

80 20 0.4 2.83

60 40 0.4

6 10

90 0.4 6.5

10 90 0.4

8 90

10 0.4 1.4 质谱条件 1.4.1 调谐参数 系统 TSQ Ultra AM 离子源极性: 正离子模式 喷雾电压: 4500V 鞘气压(N2): 50arb 辅助气压(N2): 16arb 毛细管柱温度: 350?C 碰撞气体(Ar): 1.5mTorr Skimmer offset 10V Q1/Q3峰分辨度: 0.7u (单位质量) 1.4.2 SRM 反应参数 被分析组分 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量 (V) 管透镜电压 (V) 克伦特罗-D9

286 169.1

28 104 克伦特罗

277 132.2

29 94 168.1*

28 94 203.6

15 94 * 为定量离子

2 结果与讨论 食物样品本身基质比较复杂,在进行检测之前往往 需要一个较长的样品预处理过程.比如贾晓飞等使用酶 解,高氯酸沉淀蛋白,邵兵等应用 HLB 和MCX 两次 SPE 对食品中 β2- 受体激动剂进行残留检测都取得了很好的效 果,这些方法的目的也都是为了获得更加浓缩和纯净的样 品.应用 Turbo-Flow 在线净化技术使得这些工作变得更加 图1Turbo Flow 在线净化与 HPLC 联用方法参数 热点聚焦Hotspot 简洁方便,减少了中间步骤和偶然误差,使得加标回收的 重复性很稳定,0.05?g/kg 浓度下六平行 RSD 为5.36% ;

同时由于样品更加纯净浓缩,干扰较少,此方法在添加量 为0.02?g/kg 浓度下峰型良好 ( 如图

2 所示 ).根据欧盟 法规计算此方法检出限 (LOD) 为0.002?g/kg,定量限为 0.006?g/kg 已经能轻松应对实际需要.同时如果有实际 需要,可以采用更长的净化柱 (100mm 规格 ) 或者采用串 联净化柱的方法进一步增加样品浓缩倍数, 来提高检出限. 由于采用了在线净化系统,进入分析色谱柱的样品也更 图20.02?g/kg 浓度色谱图 图320pg/g 添加回收比较图.左图为 MCX 固相萃取净化,右图为在线净化结果 为纯净, 一定程度上降低了噪音和杂峰的产生.如图

3 所示, 采用 Turbo Flow 技术一定程度上起到了稳定基线的作用. 运用 Transcend 在线净化系统的操作软件 Aria OS 的 变量设置功能,可以方便设置批处理程序尝试不同的洗 脱溶液.在比较不同浓度的氨水甲醇溶液后,结果表明 1% 的氨水甲醇溶液作为洗脱溶液的效果最优.使用外 标法计算其与不经过净化柱的结果得到其绝对回收率为 79%~84%.而且此浓度的氨水甲醇溶液以 0.2mL/min 的 速度与 0.4mL/min 的分析柱溶液混合不会对高效液相色谱 产生不良影响,在使用此方法千针后,10 个平行的保留 时间 RSD 仍然只有 0.1%. 分别配置 5pg/mL,10pg/mL,20pg/mL,50pg/mL, 100pg/mL,200pg/mL,500pg/mL,1ng/mL,2ng/mL 的克伦特罗标准溶液,其中都混有 100pg/mL 内标,内标 法定量得到标准曲线有很好的线性 ( 曲线见图 3),相关系 数R2 为0.9995 向5g 动物组织中分别添加 100pg、250pg、500pg 克伦特罗标准,内标法定量,计算其回收率结果表明,经 过在线净化和内标法校正后样品回收率非常稳定.简单的 前处理步骤带来最少的偶然误差. 表1克伦特罗不同添加水平回收率 添加水平 平均回收率% RSD%* 20pg/g 94.2 5.58 50pg/g 96.5 5.36 100pg/g 94.4 2.49 * 为六平行水平下 RSD 值3结论 采用 Turbo Flow 在线净化技术可以非常方便的按要求 得到更加浓缩,干扰更少的样品,提高了信噪比,降低了 检出限. Turbo Flow 在线净化技术简化了前处理步骤,减少了 图4克伦特罗标准曲线 热点聚焦Hotspot 偶然误差获得了令人满意的重现性. 使用 Aria OS 操作系统,我们可以很方便的设置批处 理变量,尝试不同种类或者比例的上样或者洗脱溶剂.

4 参考文献 [1] Lee D W, Mona I C, Daniel R D. J Chromatogr B. 2004, 813: 35-45 [2] Jose B, Patricia M, Miguel M, et al. Anal Chim Acta. 2005,

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20 种β2- 受体激动剂的残留 . 卫 生研究 2007,04 [6] 吴国华,邵兵,孟娟 . 气相色谱 - 质谱测定尿液中的 克伦特罗 . 中国公共卫生 ,2004,

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