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华中农业大学 生物质与生物能源研究中心 试剂配方手册

2018 年6月制 编者名单 主编:李英李丰成 编委:黄江锋 范春芬 胡慧贞 李傲徐雯孙丹汪洋胡振熊科张贵粉 蔡秋铭 赵雯悦 责编:王艳婷 涂媛苑

2013 年9月第

1 次编印

2018 年6月第

2 次修订 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 目录DNA 提取.

9 CTAB (1.5*9 EDTA 贮存液(pH 8.0, 0.5 mol/L)9 Tris・HCl 贮存液(pH 8.0,

1 mol/L)9 氯仿:异戊醇(24:1)9 75% 乙醇溶液

9 10% SDS (w/v)10 TE Buffer (1*10 蛋白酶 K(20 mg/mL)10 NaAc (5mol/L)10 RNA 提取.11

1 水稻、拟南芥 RNA 提取.11 TRIzol 法提取 RNA.11 NaAc (pH 5.2,

3 mol/L)11 75% 乙醇溶液

11 2 棉花 RNA 提取(CTAB-PVP 法)12 CTAB 法抽提 RNA

12 SSTE 法12 热硼酸法.13 大肠杆菌操作

14 LB 培养基

14 低盐 LB 培养基

14 溶液 I

14 溶液 II.14 溶液 III.15 CaCl2 溶液(0.1 mol/L)15 MgCl2 溶液(2 mol/L)15 30% 甘油(丙三醇)15 SOB 培养基.16

1 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 SOC 培养基.16 酵母操作

17 YPD 培养基(液体)17 YPD 培养基(固体)17 YPDA 培养基(液体)17 YPDS 培养基(固体)18 溶壁酶(蜗牛酶、纤维素酶 R-10)反应缓冲液.18 磷酸缓冲液(pH 7.0, 0.1 mol/L)18 酵母破碎缓冲液.18 PMSF (100 mmol/L)19 酚/氯仿(Tris 饱和酚配制)19 LiAc (1.0 mol/L)19 SD 培养基

19 X-gal 染色

20 Z 缓冲液.20 X-gal 储藏液

20 Z 缓冲液/X-gal 溶液.20 Dropout 储液(10*21 真菌操作

22 PDA 培养基(霉菌)22 产酶培养基.22 马铃薯培养基(白叶枯菌)23 燕麦培养基(稻瘟菌)23 DNS 溶液.23 水稻转基因操作

24 1 水稻组织培养主要试剂.24 N6max 母液 (20*24 N6min 母液 (1000*24 Fe2EDTA 贮存液 (100*24 Vitamin 贮存液 (1000*25

2 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 MSmax 母液 (20*25 MSmin 母液 (1000*25 2,4-D 贮存液 (1 mg/mL)26 6-BA 贮存液 (1 mg/mL)26 NAA 贮存液 (1 mg/mL)26 IAA 贮存液 (1 mg/mL)26 KT 贮存液 (1 mg/mL)26 AS 贮存液(0.002 mol/L)27 KOH 贮存液(1 mol/L)27 CN 贮存液 (50 mg/mL)27 HN 贮存液 (50 mg/mL)27 Cef 贮存液 (100 mg/mL)27 HgCl2 贮存液(10 mg/mL, 10*27

2 水稻组织培养培养基.28 诱导培养基.28 继代培养基.28 预培养.29 共培养.29 悬浮培养.30 选择培养.30 预分化.31 分化培养基.31 生根培养基.32 拟南芥转基因操作

33 次氯酸钠消毒水.33 MS 培养基(固体)33 MS 培养基(液体)33 1/2 MS 培养基(固体)34 1/2 MS 培养基(液体)34 洋葱瞬时转化操作

35 3 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 CaCl2 (2.5 mol/L)35 亚精胺(0.1 mol/L)35 常用抗生素

36 分子标记

37 6% 丙烯酰胺胶液

37 TBE (5*37 EDTA (0.5 mol/L)38 10% AP.38 硅化剂.38 染色液.38 显影液.39 Loading Buffer.39 蛋白常用试剂

40 1 蛋白提取试剂.40 1.1 水稻细胞总蛋白提取试剂.40 MOPS/NaOH buffer (pH 7.5,

50 mmol/L)40 1.2 纤维素酶蛋白提取试剂.40 NaAc Buffer (pH 5.5, 0.1 mol/L)40 1.3 β-葡萄糖苷酶提取试剂

40 柠檬酸三钠缓冲液(pH 5.0)40 1.4 水稻细胞核蛋白提取试剂.41 缓冲液 A.41 低盐缓冲液.41 高盐缓冲液.41 透析液/Dialysis Buffer.42

2 蛋白化学分析试剂.42 PBS (pH 7.4)42 Tris HCl (pH 8.0,

50 mmol/L)42 NaCl (pH 8.0, 0.5 mol/L)42 醋酸钠(100 mmol/L)42 还原型谷胱甘肽(10 mmol/L)43 Glycine-HCl (pH 1.9,

50 mmol/L)43

4 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 Brandford 显色液.43 SDS Loading buffer (5*43 30% 丙烯酰胺

43 10% AP.44 10% SDS.44 Tris (pH 8.8, 1.5 mol/L)44 Tris (pH 6.8, 1.5 mol/L)44 Tris-Gly (5*45 染色液.45 脱色液.45 转膜缓冲液.45 TBS(10*45 TTBS 缓冲液.46 封闭液.46 DAB/NiCl 显色液

46 ECL 显色液.46 一抗.46 二抗.46

3 水稻染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂

47 Extraction Buffer

1 47 Extraction Buffer

2 47 Extraction Buffer

3 48 Nuclear Lysis Buffer.48 ChIP Dilution Buffer.49 Low Salt Wash Buffer

49 High Salt Wash Buffer.49 LiCl Wash Buffer.50 TE Buffer

50 Elution Buffer

50 5 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 无DNA 酶的胰 RNA 酶(RNase A)50 酚/氯仿(Tris 饱和酚配制)50 纤维素合成

51 Mops 溶液(50 mmol/L)51 MgCl2 (100 mmol/L)51 CaCl2 (100 mmol/L)51 MnCl2 (100 mmol/L)51 Cellobiose (100 mmol/L)51 UDP-Glc (100 mmol/L)51 UDP-Ara (100 mmol/L)52 UDP-Xyl (100 mmol/L)52 蛋白酶抑制剂.52 去污剂.52 组织染色观察

53 1 纤维素染色.53

2 木质素染色.53

3 胼胝质染色.53

4 细胞壁多糖免疫荧光标记.54

5 量子点免疫荧光标记.55

6 水稻原生质体分离试剂.56 Digestion Solution 酶解液

57 W5 Solution

57 细胞壁成分测定

58 1 纤维素、半纤维素和果胶提取.58 磷酸缓冲液(pH 7.0, 0.5 mol/L)58 氯仿-甲醇(1:1)58 DMSO-H2O.58 0.5% 草酸铵

58 KOH (4 mol/L, 含1mg/mL NaHB4)58 67% H2SO4-72% H2SO4

59 6 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册

2 晶体纤维素提取.59 乙酸-硝酸-水(8:1:2)59

3 木质素提取.59 苯-乙醇

59 2.88% H2SO4 (w/w)59

4 粗纤维素提取.59 8% NaClO2 (w/v)59

5 己糖和戊糖测定.60 H2SO4-蒽酮.60 苔黑酚溶液.60 FeCl3-HCl 溶液

60 6 果胶质和糖醛酸测定.60 Na2B4O7-H2SO4

60 间羟基联苯溶液.60

7 键连接分析.61 NaOH(1 mol/L, 含1mg/mL NaHSO3)61 NaOH(4 mol/L, 含1mg/mL NaHSO3)61

8 硅烷化分析.61 甲氧基氨基盐酸盐(20 mg/mL)61

9 2-AB 衍生化分析.61

10 其他试剂.62 2% NaHCO3 (w/v)62 EDTA (1 mmol/L)62 耐热 α-淀粉酶.62 半纤维素单糖测定

63 IS.63 10% NaHB4.63 木质素单体测定

64 苯-乙醇

64 NaOH(2 mol/L)64

7 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 乙基香兰素(萃取用)内标(4mg/mL)64 二氯甲烷-乙酸乙酯(1:1)64 HCl (6 mol/L)64 HPLC 流动相

65 木质素单体标曲-HPLC.65 纤维素 DP 测定.66

1 mol/L 铜乙二胺溶液.66 细胞壁降解转化

67 醋酸缓冲液 (pH 4.8, 0.2 mol/L)67 2% NaOH (w/v)67 1% H2SO4(v/v)67 10% CaO(w/w)67 3.2 g/L 纤维素复合酶液.67 1% Tween (v/v)68 0.5% PEG4000 (w/v)68 糖醇转化

69 磷酸缓冲液(pH 4.8)69 5% K2Cr2O7

69 细胞壁孔隙度

70 Simons'

Stains 缓冲液

70 Direct Yellow 11(DY solution,

10 mg/mL)70 Direct Blue 15(DB solution,

10 mg/mL)70 磷酸缓冲溶液(pH 6.8)70

10 mg/mL 刚果红溶液.70 注:[ ]为分子量.

8 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 DNA 提取 CTAB (1.5*) CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 [364.45]………..15 g

1 mol/L Tris・HCl (pH 8.0)75 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)30 mL NaCl [58.5]61.4 g 单蒸水定容至1L,室温保存. EDTA 贮存液(pH 8.0, 0.5 mol/L) Na2EDTA ・2H2O [372.24]186.1 g NaOH [40]20 g ddH2O [18]800 mL 调节pH至8.0,单蒸水定容至1L. Tris・HCl 贮存液(pH 8.0,

1 mol/L) Tris Base…121.1 g 浓HCl…42 mL ddH2O…800 mL 调节pH至8.0,单蒸水定容至1L. 氯仿:异戊醇(24:1) 配制100 mL 溶液,氯仿96 mL,异戊醇4 mL,体积比v/v为24 :1. 75% 乙醇溶液 无水乙醇:ddH2O(v/v) = 3:1,终浓度为75%.

9 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 10% SDS (w/v) SDS [288.38]10 g 用100 mL 单蒸水溶解. TE Buffer (1*) 1mol/L Tris-HCl Buffer, pH 8.0…………5 mL 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0…1 mL 加入约 400mL ddH2O 均匀混合;

将溶液定容到 500mL, 高温高压灭菌后,室温保存. 蛋白酶 K(20 mg/mL) 将200mg 的蛋白酶 K 加入到 9.5 mL 水中,轻轻摇动,直至蛋白酶 K 完全溶解.不要涡旋混合.加水定容到

10 mL,然后分装成小份贮存于-20℃. NaAc (5mol/L) CH3COONa [82.08]41 g 加水定容到

100 mL.

10 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 RNA 提取

1 水稻、拟南芥 RNA 提取 TRIzol 法提取 RNA RNA提取试剂: TRIzol(Transgene公司购买) 其他试剂: 氯仿 异丙醇 75% 乙醇 DEPC ? H2O

3 mol/L NaAc DNase I DNase I buffer NaAc (pH 5.2,

3 mol/L) CH3COONa [82.08]24.624 g 冰醋酸调节pH至5.2, DEPC处理过的双蒸水定容至100 mL. 75% 乙醇溶液 无水乙醇 : ddH2O (v/v) = 3:1,终浓度为75%. 采用DEPC处理过的双蒸水配制.

11 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册

2 棉花 RNA 提取(CTAB-PVP 法) CTAB 法抽提 RNA RNA 提取缓冲液: 2% CTAB(w/v) 2% PVP-40(w/v)

100 mmol/L Tris-HC1(pH 8.0) 0.5 g/L 亚精胺 2.0 mo1/L NaCl 2% 巯基乙醇(w/v,使用前加入) 其它试剂:

4 mol/L 硫氰酸胍

42 mmol/L 柠檬酸钠 0.83% 十二基肌氨酸钠 1%-2%(w/v)PVP40 1%(v/v)β-巯基乙醇(现配现用) 苯酚:氯仿:异戊醇(25: 24:1) SSTE 法1mol/L NaCl 0.5% SDS(w/v)

10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 1.0 mmol/L EDTA

12 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 热硼酸法 RNA 提取缓冲液:

200 mmol/L 十水四硼酸钠 [381.37]………….7.6274 g

30 mmol/L EGTA [380.35]1.1411 g 1%(w/v)SDS [288.38]1 g 1%(w/v)脱氧胆酸钠 [414.55]1 g 2%(w/v)PVP-40…2 g 用DEPC ddH2O 定容至

100 ml. 其它试剂:

1 mol/L DTT

20 mg/ml Protein K 1.8 mol/L KCl

8 mol/L LiCl

2 mol/L KAc(pH5.5)

13 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配方手册 大肠杆菌操作 LB 培养基 NaCl [58.5]10 g 蛋白胨…10 g 酵母提取物…5 g 单蒸水定容至

1 L,固体添加

15 g 琼脂.

121 o C 灭菌

20 分钟,冷到

55 o C 左右,加抗生素. 低盐 LB 培养基 (用于 Zeocin 抗生素) NaCl [58]5 g 蛋白胨…10 g 酵母提取物…5 g 单蒸水定容至

1 L,固体添加 1.5%琼脂. 121o C 灭菌

20 分钟, 冷到 55o C 左右, 加抗生素 Zeocin, 避光 4o C 保存. 溶液 I 葡萄糖 Glucose・H2O [198] ………………0.99 g 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)2 mL

1 mol/L Tris (pH 8.0)2.5 mL 单蒸水定容至

100 mL,高压灭菌 4o C 保存. 溶液 II NaOH [40]0.80 g SDS [288]1.0 g 单蒸水至

100 mL,4℃保存.

14 华中农业大学生物质与生物能源研究中心试剂配........