PDF《石蜡切片免疫组化染色步骤》

石蜡切片免疫组化染色步骤

1、载玻片的处理: 抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造 成脱片.

为保证试验的正常进行,可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、 ZLI-9003 HistogripTM 或ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种试剂, 对已清洗的载 玻片进行处理.具体方法如下: 1.1 APES:现用现配.将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中, 停留 20~30 秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结 合的 APES,置通风橱中晾干即可.用此载玻片捞片时应注意组织要一 步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果. 1.2 Histogrip TM : 将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中, 停留 1~2 分钟,然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或 60o C 烤箱烘 烤一小时,装盒备用. 1.3 Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀 释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡

5 分钟,60o C 烤箱烘烤一小时或室温过夜 干燥.装盒备用.试验中使用的器具均为非玻璃制品.

2、常用酶消化: 2.1 胰蛋白酶:一般使用浓度为 0.05%~0.1%,消化时间为 37℃、10~40 分钟,主要用于细胞内抗原的显示. 2.2 胃蛋白酶:一般使用浓度为 0.4%,消化时间为 37℃、30~180 分钟,主 要用于细胞间质抗原的显示,如:Laminin(层粘蛋白) ,Collagen IV(IV 型胶原)等. 2.3 皂素(Saponin) :一般使用浓度为 2~10?g/ml 的saponin 溶液,消化时 间为室温孵育

30 分钟.

3、抗原热修复: 可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或 水浴高温抗原修复.抗原热修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金 属盐溶液等,但实验证明,以0.01M 枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果最好. 请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制,取该粉剂一 包溶于 1000ml 的蒸馏水中,混匀,其pH 值在 6.0 ± 0.1,如因蒸馏水本身 造成的 pH 值偏差,请自行调整. 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3%H2O2 处理

10 分钟,蒸馏水洗

2 分钟*3.将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作 液)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 92℃~98℃之 间并持续 10~15 分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具 体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求) .取 出容器,室温冷却 10~20 分钟(注意: 不可将切片从缓冲液中取出冷却, 以便使蛋白能够恢复原有的空间构型) .PBS 洗,下接免疫组化染色步 骤. 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水.将1500ml~3000ml 的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾.切片置 于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀.当压力锅开 始慢慢喷气时(约加热 5~6 分钟后) ,计时 1~2 分钟,然后将压力锅端 离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗 后,PBS 洗2分钟*3,下接免疫组化染色步骤. 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方 法:切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,并 将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小 容器的温度到达 92℃~98℃起开始计时 15~20 分钟,然后端离电炉,室 温冷却 20~30 分钟,蒸馏水冲洗,PBS 洗,下接免疫组化染色步骤.

4、免疫组化染色步骤: (以美国 ZYMED 公司 SP 试剂盒为例) 石蜡切片脱蜡至水. 3%H2O2 室温孵育 5~10 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性. 蒸馏水冲洗,PBS 浸泡

5 分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行). 5~10%正常山羊血清(PBS 稀释)封闭,室温孵育

10 分钟.倾去血清, 勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育 1~2 小时或

4 ℃过夜. PBS 冲洗,5 分钟*3 次. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS 稀释) ,37℃孵育 10~30 分钟;

或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育 10~30 分钟. PBS 冲洗,5 分钟*3 次. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释) ,37℃孵育 10~30 分钟;

或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育 10~30 分钟. PBS 冲洗,5 分钟*3 次. 显色剂显色(DAB 或AEC) . 自来水充分冲洗,复染,封片. 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片 4~8?m,室温放置

30 分钟后,入4℃丙酮固定

10 分钟, PBS 洗,

5 分钟*3.用3%过氧化氢孵育 5~10 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性. PBS 洗,5 分钟*2. 下接免疫组化染色操作步骤. 几种溶液的配制方法

1、PBS: 取ZLI-9061 PBS 溶于 1000ml 的蒸馏水中,混匀,测pH 值应在 7.2~7.4 之间,若偏离此范围,请用 0.1N 的HCL 或NaOH 调整.

2、TBS: 2.1 Tris 缓冲液配方: (0.5 M pH7.6) Tris(三羟甲基氨基甲烷) 60.57g 1N HCL 约420ml 双蒸水 加至 1000ml Tris 缓冲液配制方法: 先以少量双蒸水 (300~500ml) 溶解 Tris, 加入 HCl 后, 用HCl (1N) 或NaOH(1N)将pH 调至 7.6, 最后双蒸水加至 1000ml.此液为储备 液,4℃冰箱中保存. 2.2 TBS 配方: Tris-HCI 缓冲液(0.5M pH7.6) 100ml NaCI 8.5~9g (0.15mol/L) 双蒸水 加至 1000ml TBS 配制方法: 先以少量双蒸水溶解 NaCl,再加入 Tris-HCl 缓冲液,最后加双蒸 水至 1000ml,充分摇匀.

3、枸橼酸盐缓冲液(Citrate buffer) : 3.1 储存液: A. 0.1M 枸橼酸溶液:称取 21.01g 枸橼酸(C6H8O7・H20)溶于 1000ml 蒸馏水中. B. 0.1M 枸橼酸钠溶液:称取 29.41g 枸橼酸钠(C6H5Na3O7・2H20)溶于 1000ml 蒸馏水中. 3.2 工作液: 取9ml A 液和 41ml B 液加入 450ml 蒸馏水中,溶液 pH 值应为 6.0±0.1

4、胰酶(Trypsin) : 4.1 ZLI-9011 胰蛋白酶消化液: 常用浓度为 0.125%, 即使用前将一滴试剂

1 胰酶溶液和三滴试剂

2 胰酶 稀释液均匀混合(1:3 稀释) ,则可直接滴加使用.胰酶的最终浓度可以 根据使用者的要求进行调整, 浓度范围可以从 0.05% (1:10 稀释) 至0.25% (1:1 稀释) . 4.2 ZLI-9010 胰蛋白酶: 取0.05g 或0.1g 胰蛋白酶加入到 100ml 0.05%或0.1% pH7.8 的无水氯化 钙水溶液中,溶解即可.

5、胃酶(Pepsin) : 4%胃蛋白酶,用0.1mol/L HCL 配制. (我公司备有 ZLI-9013 胃蛋白酶消化工作液,不需稀释直接滴加使用,欢 迎选购)

6、DAB: 6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit: 使用前只需将试剂盒提供的 A、B、C 三种试剂各一滴加至 1ml 双蒸水 中,即可获得 1ml DAB 工作液,简单易用. 6.1 ZLI-9030 DAB: 6mgDAB 溶于 10mlTBS(0.05M pH7.6) ,再加入 0.1ml 浓度为 3%的H2O2,过滤掉沉淀物,即可.

7、AEC: 4mg AEC 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中, 加入 14ml 浓度为 0.1M 的醋酸缓冲液 (pH5.2) ,然后加入 0.15ml 3%H2O2,过滤掉沉淀物.

8、RIPA: 1*PBS,1%NP 40,0.5 sodium deoxycholate,0.1% SDS(此液体可长期保 存) .以下抑制剂以储存液方式保存,临用前加入 RIPA 中. 8.1 10mg/ml PMSF 异丙醇溶液(用量为 10?l/ml) 8.2 Aprotinin(Sigma 产品,用量为 30?l/ml) 8.3 1000mM sodium orthovanadate 冷冻液 (用量为 10?l/ml)

9、Blotto A: 常规使用 1*PBS,5% milk,0.05% Tween 20.

10、Blotto B: 与Phosphotyrosine 抗体共用,1*PBS,1% milk,0.05% Tween 20.部分实验 中milk 可完全去除,但可能引起背景增高. 免疫组化常见问题的处理 当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排 除一种可能的原因. 对照/标本无染色 ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等. ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入,是否孵育了足够的时间. ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统是否和 一抗匹配,这一点是非常重要的.比如,如果一抗是兔来源的抗体,二抗一 定要用抗兔的二抗来匹配;

或一抗是小鼠的 IgM 一抗,二抗必须是山羊/兔 抗小鼠的 IgM(不是 IgG)二抗. ④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液. ⑤ 检查抗体的有效期和保存条件,尤其是标记了酶或荧光素的抗体,现在大 多数试剂公司的抗体均要求在 4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保 存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价. ⑥ 检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照. ⑦ 检查色原/底物溶液, 最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制 备好的底物溶液中,如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物的因素. 需要注意的是, 有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完, 否则会失效. ⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配,溶液的 pH 值很重要,与过氧化物酶底 物匹配的溶液中不应含有叠氮钠. ⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配. 弱阳性 如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性,除了考虑上述因素外,还 应考虑: ① 标本的固定方式,不当的固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测 的抗原的数量和质量. ② 不适当的抗原修复方式,由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封 闭作用, 必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法, 至于 使用哪一种方法,应参照生产厂家的说明,同时结合标本的具体情况而定. ③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确. 一般试剂生产厂家 都会对试剂给出一定的使用范围, 但是由于使用者的标本来自各种组织, 处 理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度测试, 找出最佳的使用浓度. ④ 切片上遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进 行了进一步的稀释. ⑤ 孵育时切片是否放置水平,否则会导致抗体流失. 如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而标本弱阳性,则可能是 由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致. 非特异性染色 ① 是否有效地去除了内源性酶和生物素.应注意的是,并不是每一种组织均 需要进行此步骤,但对于内源性酶或生物素丰富的组织,如肝脏、肾脏等, 需考虑此原因.处理的方法为: 灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪唑(24mg/m1)加入底物液中, 并保持 pH 值在 7.6~8.2, 即能除去大部分内源性碱性磷酸酶, 对于仍能干扰 染色的酸性磷酸酶,可用 50mmol/L 的酒石酸抑制. 饱和处理内源性生物素: 消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素,以饱 和内源性生物素,使之不再有剩余的结合位点.具体方法是在 ABC 法或 SP 法染色前将切片浸于 25ug/ml 亲和素溶液中处理

15 分钟, PBS 清洗

15 分钟 后即可染色........