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BOSTER 博士德生物 Product Information 地址:武汉市关山二路特一号国际企业中心

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电话:800-880-8748,(027)67845390/1/2/3/5 传真:(027)67845396

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网址:www.boster.com.cn BOSTER 在/平/凡/中/创/造/奇/迹BOSTER_ Enhanced Sensitive ISH Detection KitⅠ(POD) 敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(过氧化物酶) 产品编号:MK1030 保存:置4℃. 工作量:100 张切片. 有效期:一年. 所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法,在显微镜水平检测和定位特异的核苷 酸片段.现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生,发展和调控等根本 性问题的有力工具,其作用是免疫组化所无法代替的. 博士德专门设计了敏感性加强型原 位杂交检测试剂盒.具有敏感性特高,操作简便和结果准确的优点.该试剂盒分为两种,一 种为过氧化物酶检测,一种为碱性磷酸酶检测系统. 用于 mRNA 的杂交.MK1030 和MK1032 仅适于地高辛高效标记的寡核苷酸探针,不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高 辛的寡核苷酸探针. 如果使用 cDNA 探针,应在杂交之前变性探针. 试剂盒中内容――MK1030: 试剂盒中内容 1.胃蛋白酶(*10;

Pepsin)2ml;

2. 预杂交液 2ml;

3.寡核苷酸探针杂交稀释液 2ml;

4. 封闭液 5ml;

5.生物素化鼠抗地高辛 5ml;

6. SABC-POD 5ml;

7. 生物素化过氧化物酶 5ml. 用户自备试剂:原位杂交专用盖玻片(博士德有售) ;

POLY-L-LYSINE;

DEPC;

20%甘油 缓冲液(3%柠檬酸,2*SSC,0.5*SSC,0.2*SSC, 0.5M PBS ) 一.培养细胞和冰冻切片 准备工作:缓冲液的配备 3%柠檬酸――100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7・H2O)3g,PH2.0 左右. 2*SSC――1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g, 柠檬酸三钠 (C6H5O7Na3・ 2H2O, 分子量 294) 8.8g. 0.5*SSC――300ml 蒸馏水加 100ml 2*SSC 即可. 0.2*SSC――270ml 蒸馏水加 30ml 2*SSC 即可. 20%甘油――20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可. 0.5 M PBS ――1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4 ・ 12H2O 6g, NaH2PO4 ・ 2H2O 0.4g,PH7.2-7.6. 操作程序: 注意: 最重要的是及时固定, 并在固定液中加入 0.1%的DEPC 处理, 以抑制 RNA 酶对 mRNA 的分解作用. 1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或 APES.切片厚度 10-20μ m. 2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为 37℃和5%的CO2,所用培养基为 Dulbecco 基础培养基.细胞长好后 0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟*3 次. 3. 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定: 固定液为 4%多聚甲醛/0.1 M PBS, 含有 1/1000 DEPC.室温固 定20--30 分钟.蒸馏水洗,干燥后可-20℃冰冻保存

2 周. 4.30%H2O2 一份+甲醇

50 份混合,室温处理

30 分钟以灭活内源性过氧化物酶.蒸馏水洗 涤3次. 5. 暴露 mRNA 核酸片段: 切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 (1ml 3% 柠檬酸加

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网址:www.boster.com.cn BOSTER 在/平/凡/中/创/造/奇/迹BOSTER_ 滴浓缩型胃蛋白酶, 混匀) , 37℃或室温消化 5―120 秒钟. 有时也可以不消化. 0.5M PBS 洗3次*5 分钟.蒸馏水洗

1 次. 6. 预杂交:湿盒的准备――干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度.按每张切片

20 μ ι 加预杂交液.恒温箱 37-40℃2―4 小时.吸取多余液体,不洗. 7. 杂交――用杂交稀释液 稀释地高辛标记的寡核苷酸探针,浓度一般 0.5-2μ g/ml.按每 张切片加 20μ ι 杂交液. 将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后, 盖在切片上. 恒温箱

37 ―40℃杂交过夜. 8. 杂交后洗涤:去掉盖玻片,30―37℃左右水温的 2*SSC 洗涤

5 分钟*2 次;

0.5*SSC 洗涤

15 分钟*1 次;

0.2*SSC 洗涤

15 分钟*1 次. 必要时可重复 0.2*SSC 洗涤

1 次. 9.滴加封闭液:37℃30 分钟.甩去多余液体,不洗 10.滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃60 或室温

120 分钟.0.5M PBS 洗5分钟*4 次.勿 用其它缓冲液和蒸馏水洗涤. 11.滴加 SABC:37℃20 分钟或室温

30 分钟.0.5M PBS 洗5分钟*3 次.勿用其它缓冲 液和蒸馏水洗涤. 12.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20 分钟或室温

30 分钟.0.5M PBS 洗5分钟*4 次. 13.DAB 显色:使用 DAB 显色试剂盒―1ml 蒸馏水加显色剂A,B,C 各一滴,混匀,加 至标本上.镜下控制显色,一般在

30 分钟内.若无背景出现则可继续显色.也可自配 DAB 显色剂后显色.充分水洗. 14.必要时苏木素复染,充分水洗. 15.酒精脱水,二甲苯透明,封片. 二.石蜡切片 如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本.标本离体后,及时予以固定.固定液为 4%多 聚甲醛/0.1 MPBS,含有 1/1000 DEPC.标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm 的小块, 固定

1 小时即可,较大的标本固定不要超过

2 小时.某些组织对过度固定尤其敏感,如动 物大脑,固定时间 30-40 分钟,一定不要超过

1 小时. 1. 常规脱水、浸蜡、包埋.切片厚度 6-8μ m. 2. 玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或 APES. 3. 石蜡切片经常规脱蜡至水.3%H2O2 室温处理

10 分钟以灭活内源性过氧化物酶.蒸馏 水洗涤

2 次. 4. 暴露 mRNA 核酸片段: 切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 (1ml 3% 柠檬酸加

2 滴浓缩型胃蛋白酶,混匀) ,37℃或室温消化 3--30 分钟(视标本厚薄、新旧自行调整) .充 分的消化可以使 mRNA 得到暴露,从而增强杂交信号;

但另一方面,过度的消化又使切片 明显减薄乃至消失,从而失去杂交信号.由于用户的切片情况各不相同,这就需要用户比较 不同的消化时间,例如

10 分钟,20 分钟,30 分钟,以找到最佳的消化时间.0.5M PBS 洗3次*5 分钟.蒸馏水洗

1 次. 其余步骤和冰冻切片 6-15 步相同. 结果观察:阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色. 注意事项:如果有少量的细胞核着色属于正常情况;

如果出现大量的细胞核着色,往往和标 本固定时间过长有关,应重新处理标本.有其它明显的非特异性染色现象时,可以用预杂交 液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释 2―5 倍.