PDF《说明书》

Genloci pGK2.

0(Neor ) vector 说明书 Cat. No. GP0127 Protocol No. PT161215-1 出版日期 Dec.

2016 南京市汉中门大街

301 号 南京国际服务外包产业园

01 栋13 层A座

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2 III. 产品概要…3-4 IV. 操作步骤…5 1. 设计 Oligo DNA 序列…5 2. pGK2.0(Neor ) vector 线性化处理…6 3. 获得双 gRNA 克隆框…6 4. 片段的胶回收和酶切…6 5. T4 DNA Ligase 连接和筛选…6-7 6. 电转染靶细胞…7 7. Cruiser? 筛选阳性克隆…7 V.FAQ…8 VI. 附录…9 VII.参考文献…10 图Figure 1. CRISPR/Cas9 工作原理示意图 Figure 2. CRISPR/Cas9 基因编辑实验流程 Figure 3. pGK2.0(Neor ) vector 插入位点图示 Figure 4. pGK2.0(Neor ) vector 质粒图谱 Genloci pGK2.0(Neor ) vector Protocol No. PT161215-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 2/10 I.规格与贮存条件 在收到货后,请您先瞬时离心后再置于-20℃保存,且避免污染;

Cat. No. 产品名称 规格 GP0127 pGK2.0(Neor )

4 μg II.附加产品推荐 本试剂盒不包含以下所需试剂和仪器,您可以购买指定产品或购买替代产品进行实验. ? Genloci TNA 抽提试剂盒 (Cat.No.:GP0155,GP0156) ? Genloci Cruiser? 基因敲除检测试剂盒(Cat.No.:GP0102,GP0103) ? Genloci Cruiser? Enzyme(Cat. No.:GP0104,GP0105,GP0106) ? Celetrix 细胞电转仪(Cat.No.:GP7901) ? Cell Plaza? 单细胞培养板(Cat.No.:GP5036) ? Annealing Buffer(10x)(Cat.No.:GP0124,GP0125) Genloci pGK2.0(Neor ) vector Protocol No. PT161215-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 3/10 III.产品概要 Genloci pGK2.0(Neor ) vector 是一款高效、精准的基因编辑载体,它是基于最新一代的人工核酸内切 酶CRISPR/Cas9 而研发的,相对于传统敲除技术和 TALEN、ZFN 技术而言,其操作更加简便,敲除效率 最高,基因的编辑更加的精准,大大降低了脱靶机率.Genloci pGK2.0(Neor ) vector 能够适用于几乎所有 哺乳动物细胞的基因修饰研究. Genloci pGK2.0(Neor ) vector 包含

2 个重要组件,分别为 Cas9 核酸酶表达框和 Guide RNA(gRNA)克 隆框,gRNA 克隆框含有两个敲除插入位点,能够快速高效的克隆编码靶标特异的 CRISPR RNA(crRNA) 的DNA 片段,实现同基因大片段的缺失或同时敲除两个不同基因.该载体能够让您仅靠单个载体就可以轻 松地完成基因组 DNA 的编辑,实现精准、低off-target 的基因编辑体验. Genloci 公司为您提供完整的基因敲除解决方案, 从敲除方案设计→敲除位点设计→载体构建→转染→ 敲除检测→结果分析,让您的实验一次成功! 产品特点精准的修饰 Cas9 蛋白无特异性,降低脱靶效应,实现精准的基因编辑 敲除效率高 较传统技术和 TALEN、ZFN 技术,敲除效率最高;

CRISPR/Cas9 系统的两大功能组件于一个载体上,转染效率更高. 双敲除:gRNA 克隆框含有两个敲除插入位点,可以实现同基因大片段的缺失或同时敲除两个不同基因. Figure1. CRISPR/Cas9 工作原理示意图 Genloci pGK2.0(Neor ) vector Protocol No. PT161215-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 4/10 CRISPR/Cas9 基因编辑实验流程图如下: Figure 2. CRISPR/Cas9 基因编辑实验流程 设计

2 条单链 oligo 序列;

PCR 双gRNA 克隆框并 BbsI 酶切. 将双 gRNA 克隆框克隆入敲 除载体中. 转化大肠杆菌细胞;

筛选阳性 克隆;

测序验证序列;

质粒大 提;

电转染靶细胞. 在细胞内 crRNA 识别靶位点, Cas9 对靶位点进行随机剪切. Cruiser? 酶切细胞池, 计算突变率;

Cruiser? 酶切初筛阳性克隆;

将阳 性克隆测序验证;

TA 克隆,做敲 除序列比对分析.

1 2

3 4

5 Genloci pGK2.0(Neor ) vector Protocol No. PT161215-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 5/10 IV. 操作步骤 实验前,请您务必做好以下验证实验: A.单细胞生长情况,确保单个细胞可以正常生长形成单克隆,即,低密度的细胞在培养皿中可以 形成单克隆. B.目的基因的表达情况分析,为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失,首先需要 PCR 扩增 靶基因,并对 PCR 结果进行测序,确保靶基因的完整存在;

其次,您还可以用 RT-PCR 分析 靶基因的活跃度. 1. 设计 Oligo DNA 序列 首先, 您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 oligo DNA, 敲除位点的选择您可以通过以下在线工具选择: 麻省理工学院的 CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/ 德国癌症研究中心的 E-Crisp:www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html 根据您选择好的两个 Guide 序列(20bp 左右) ,按下列原则设计您的引物. Primer-F:5'

_GAGAAGACGGAAAC-(20bp 靶位点反向+T)-CCTAGATCTGTGGTCTCATAC_3'

Primer-R:5'

_GAGAAGACGGAAAC-(20bp 靶位点反向+C)-CCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC_3'

注意:a.GAAGAC 为BbsI 酶切位点 b.由于 H1 promoter 的转录起始位点为 A,如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 A,应在设计上游引物时加上一个 T,见上方红色 加粗字体,但有研究表明:将H1 启动子的+1 位腺苷酸更换为尿苷酸、胞苷酸、鸟苷酸,似乎并不影响启动子的转录活性. c. 由于 U6 promoter 的转录起始位点为 G,如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G,应自行加一个 G 上去,见上方红色加粗字体. 下面我们选择麻省理工学院的 CRISPR Design 工具来做设计举例,以human Fut8 基因为例,一次只 能输入大小为 23~250bp 的基因片段,最好一次只输入一个外显子,避免 Guide 序列跨内含子的. 点击 Download as genbank 按钮,出现以下界面: 根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列,score 的高低并不代表敲除效率的高低, 所以为提高 敲除的成功率,一般选择 3~5 个Guide 序列,先构建 3~5 个单敲除载体.后续先在 pool 细胞的基础上验 证出有效的位点,再拿有效的两个位点构建双敲载体,做正式电转,筛选单克隆.以Guide#1 和Guide#2 序列为例(Guide#1:AATGAGCATAATCCAACGCC AGG、 Guide#2:CATGGACTGGTTCCTGGCGT TGG),2 条单链 oligo Genloci pGK2.0(Neor ) vector Protocol No. PT161215-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 6/10 的序列如下: Primer-F:5'

-GAGAAGACGGAAACGGCGTTGGATTATGCTCATTC........