编辑: 思念那么浓 | 2019-07-17 |
2. 调整蛋白样品的浓度,使各个实验组、空白组和Model组蛋白浓度保持一致, 并使其在后续的上样中,每孔样品所含的蛋白总抽提物在20-40μg左右;
3. 蛋白变性:5*SDS上样缓冲液20μL+1M二硫苏糖醇(DTT)10μL+适量纯水统 一成浓度为1 μg/μL的蛋白样品混匀;
4. 样品混匀后,水浴或者金属浴加热变性5min(或70℃加热5-10min),简短 离心,取上清,-20℃短期或-70℃长期保存. 5. 20-40μg蛋白质也就是20-40μl定量 好的样品,用移液器缓慢加入,防 止样品溢出,同时在一个样品孔中 加入2-5 μl预染蛋白marker. 电泳 ? 10*电泳缓冲液(1L) Tris碱33g 甘氨酸 144g 10%SDS 100ml ? 盖好电极盖(红-红,黑-黑),设 Z为恒压80V,电泳约30min,各 样本跑至积层胶末端(浓缩胶和分 离胶的分界面)后,调节电压至 120~160V,继续电泳约90min, 待溴酚蓝前沿距电泳槽底部1cm时, 停止电泳. 转膜 准备 1. 长10cm,宽8.5cm的滤纸若干和长8.5cm,宽5.5cm的硝酸纤维素膜若干;
注:剪裁滤纸和硝酸纤维素膜是一定要戴一次性手套,防止手上的蛋白和手 套上的杂志污染滤纸和膜;
2. 硝酸纤维素膜一定要用甲醇激活,方法是将硝酸纤维素膜放Z于甲醇中1min;
3. 配制1*转膜缓冲液,并将适量1*转膜液倒入搪瓷盘中,同时放入转膜用的 夹子、镊子、两块海绵垫、一支玻璃棒、滤纸和激活的膜;
4. 将夹子打开,使黑色的一面保持水平.在上面垫一张海绵垫,用玻璃棒来回 擀几遍以擀走里面的气泡(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动). 10*转膜缓冲液(1L) Tris碱33g 甘氨酸 144g 1*转膜缓冲液(1L) 10*转膜缓冲液 100mL 甲醇 200mL 超纯水 700mL 转膜(湿转) 1. 将胶板从电泳槽中取出,用超纯水冲洗干净, 撬开胶板,将浓缩胶轻轻刮去,要避免把分离 胶刮破,取出凝胶,放在装有转膜缓冲液的搪 瓷盘中浸泡10min;
2. 将准备好的转膜用夹层水平Z于搪瓷盘中,按 照顺序:夹子黑色一面―滤纸―凝胶―硝酸纤 维素膜―滤纸―透明夹子一面,整齐叠放,小 心清除叠层中的气泡;
3. 将夹子放入转移槽中,要使夹子的黑色一面对 着槽的黑面,夹子的白色一面对着槽的红面. 电转仪过程中会产热,需要将转移槽放Z在装 有冰水混合物的容器中. 4. 转膜电压一般为80V,转移1.5h,可根据目的 蛋白分子量的大小进行调整. 干转/半干转? 半干转膜仪 封闭 1. 为防止一抗/二抗与膜的非特异性结合产生的高背景,因此需要进行膜的封闭. 传统上有两种封闭液:脱脂奶粉和牛血清白蛋白(BSA),脱脂奶粉因含有酪 蛋白,而该蛋白本身是一种磷酸化蛋白,因此脱脂奶粉不能用于磷酸化蛋白, 使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体而易产生高背景,但是脱脂奶粉的成本比较 低,所以如果不是磷酸化蛋白可使用脱脂奶粉.某些抗体用BSA封闭时因不明 原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号,请仔细阅读说明说注明的注意事项 和膜的特殊封闭方法. 2. 将PVDF膜放入盛有5%封闭液的小盒中,膜与胶紧密结合的一面朝上,Z于摇 床上,室温孵育1h. 孵育一抗 1. 根据目的蛋白的分子量大小剪裁PVDF膜;
2. 根据抗体说明书或者自己做实验摸索的比例用一抗稀释液稀释一 抗,选择大小合适的容器,将剪裁好的PVDF膜和稀释好的一抗 放在容器中;
3. 用保鲜膜封闭容器或者直接盖上盖子,Z于4℃冰箱的摇床上孵 育过夜(12~16小时). 4. 将容器中的一抗收集起来,放在4℃或者-20℃冰箱保存;