PDF《Ad-mCherry-GFP-LC3B》

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网址:http://www.beyotime.com 碧云天网站 微信公众号 Ad-mCherry-GFP-LC3B 产品编号 产品名称 包装 C3011-1ml Ad-mCherry-GFP-LC3B 1ml C3011-10ml Ad-mCherry-GFP-LC3B 10ml 产品简介: ? Ad-mCherry-GFP-LC3B,即adenovirus expressing mCherry-GFP-LC3B fusion protein,是一种可以表达mCherry-GFP-LC3B融 合蛋白的腺病毒,可以用于感染细胞或组织后进行细胞自噬(autophagy)的检测. ? LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白.LC3最初被分析鉴定为microtubule-associated protein

1 light chain

3 (MAP1LC3).LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亚家族,其中对于LC3B的研究最为广泛.到目前为止,LC3B 被认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白.LC3B是一个具有125个氨基酸残基的蛋白,在蛋白合成后,被Atg4所 酶切而失去了C端的22个氨基酸蛋白,从而暴露出C端的甘氨酸,人们把它命名为胞质形式的LC3B I.在细胞自噬的过程 中,其C端暴露的甘氨酸经过一个类似泛素化的过程,以ATG7为E1样激活酶(E1-like activating enzyme),以ATG3为E2样连 接酶(E2-like conjugation enzyme),以Atg12-Atg5-Atg16复合物为E3样连接酶(E3-like ligase),在C端甘氨酸上共价连接上磷 脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)而成为LC3B-PE即LC3B II.与胞质定位的LC3B I不同,LC3B II定位于自噬体 (autophagosome)的内膜和外膜上.在自噬体与溶酶体融合后,自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切,而自噬体内膜上的 LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解.尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大,但由于其极强的疏水性,在SDS-PAGE电泳 时,LC3B II比LC3B I迁移得更快,其表观分子量分别为14kD和16kD.自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶 酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径.自噬与多种生理功能有关,在饥饿等不利的环境条件下,细胞通过 自噬降解多余或异常的细胞内组分,为细胞的生存提供能量及原材料,促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产 生应答.自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系.由于细胞自噬在生 理和病理过程中都有重要作用,自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点. ? Ad-mCherry-GFP-LC3B是碧云天自行研发的重组腺病毒,感染后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白mCherry、绿色荧 光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白,呈现明亮的红色和绿色荧光,可以用于细胞自噬的检测. ? 自噬小体在与溶酶体融合过程中,溶酶体内的酸性环境会导致GFP荧光淬灭,这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难 度.mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的单体红色荧光蛋白,当其与GFP进行LC3B的共同标记时,在GFP被 溶酶体酸性环境所淬灭的情况下,可以发出红色荧光的mCherry因为其卓越的稳定性而被保留.因此,通过融合表达 mCherry-GFP-LC3B蛋白,可以非常有效地追踪自噬过程.在用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染细胞后,在非自噬的情 况下,荧光显微镜下mCherry-GFP-LC3B以弥散的黄色荧光(mCherry和GFP的综合效果)形式存在于细胞质中;

而在自噬的 情况下,荧光显微镜下mCherry-GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上,以黄色斑点的形式表现出来(LC3B dot or punctae);

当自 噬体与溶酶体融合后,因GFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来. ? 腺病毒感染细胞后为瞬时表达,通常不会与基因组DNA重组,不能用于筛选稳定细胞株.本产品感染体内外细胞后,有效 表达时间通常不少于7天,不同细胞和组织的有效表达时间有所不同.感染10-14天后融合蛋白的表达很可能会大大减弱. ? 碧云天的Ad-mCherry-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重组腺病毒载体系统,感染普通的细胞后不能进行扩增和重组,从 而可以有效降低本产品在活体生物中的风险. ? 本产品可以在表达E1的HEK293A、HEK293等适当细胞中扩增. ? 本产品的滴度≥1*108 pfu/ml,使用时可以按照108 pfu/ml进行计算.如果按照20 MOI感染6孔板的细胞,每孔50万细胞计 算,每毫升本产品共可以感染10个孔;

如果按照20 MOI感染24孔板的细胞,每孔10万细胞计算,每毫升本产品共可以感染 50个孔.如果MOI值提高,则相应可以感染的孔数会减少;

如果MOI值降低,则相应可以感染的孔数会增加. 包装清单: 产品编号 产品名称 包装 C3011-1ml Ad-mCherry-GFP-LC3B 1ml C3011-10ml Ad-mCherry-GFP-LC3B 1ml*10 ― 说明书 1份 保存条件: -80?C保存,一年有效.-20?C保存,1-2个月内有效.4?C保存,一周内有效. 注意事项:

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4 C3011 Ad-mCherry-GFP-LC3B 400-1683301/800-8283301 碧云天/Beyotime ? 反复冻融会降低病毒滴度,如有必要请在收到本产品后分装保存.病毒融解后,如果在一周内使用,可以放置于4?C.如果-80?C保存时间超过一年,可能会导致滴度下降,此时建议重新测定病毒滴度. ? 腺病毒感染需要细胞表面的CAR受体,请确认拟使用的细胞或组织可以被腺病毒感染. ? 本产品使用前请仔细阅读附录1《腺病毒使用安全规范》 .本产品生物安全等级为Biosafety Level

1 (BSL-1),没有确凿证据 显示会导致健康成人产生疾病(Not known to consistently cause diseases in healthy adults),可以按照常规的微生物实验操作要 求进行操作(Standard microbiological practices). ? 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内. ? 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作. 使用说明: 1. 感染条件的确定: 不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的,如果是初次使用腺病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件. a. 细胞培养(以6孔板NIH3T3细胞为例,其它培养板或培养皿参考6孔板进行操作):感染前一天在6孔板中以5*105 /孔接种 NIH3T3细胞,每孔加入2ml完全培养液(具体的接种数量由细胞大小和细胞生长速度而定),使第二天病毒感染时细胞密 度达到约50%左右. b. 按照MOI 分别为

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20、40,计算所需病毒量,计算方法请参考附录2. c. 冰上解冻病毒,混匀后备用. d. 从细胞培养箱中取出6孔板,在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好.吸弃旧培养液,每孔加入1.2ml新鲜培养液,并分 别加入特定MOI值的病毒液,同时设置未加入病毒的细胞孔作为对照组.须特别注意在病毒感染时加入尽量少的新鲜 培养液,以提升病毒的感染效率.对于培养液体积比较小的多孔板,例如96孔板和48孔板,也可以先把病毒用培养液 稀释至所需的MOI值后再加入. e. 感染后约24h,除去含有病毒的培养液,每孔加入2ml新鲜的完全培养液,继续培养24h后观察细胞生长状况及荧光蛋白 表达情况(参考图1),以不显著影响细胞生长、荧光较强且感染效率便于荧光观察的MOI值和感染后时间为最佳条件. 注1:检测细胞自噬时并非感染效率越高越好,通常约20-70%的感染效率已经足以进行自噬检测,感染效率过高反而容 易产生细胞毒性而干扰检测. 注2:通常在腺病毒感染细胞后24小时即可观察到荧光蛋白表达的出现,在48小时左右有较强的表达效果. 注3:对于感染腺病毒后出现较强细胞毒性的情况,可以尝试在感染后6-12h更换成新鲜的完全培养液. 图1. Ad-mCherry-GFP-LC3B感染细胞的效果图.A、B、C、D、E和F依次为Ad-mCherry-GFP-LC3B分别在MOI值为

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10、20和40时感染NIH3T3细胞48h后的实拍效果图.上侧为明场照片,下侧为相同视野的荧光照片. 2. 感染细胞、诱导自噬和荧光观察 按照步骤1. 获得的条件进行感染实验,适当条件诱导自噬(如EBSS或者细胞自噬激活剂处理等),随后可在荧光显微镜下观 察LC3B的荧光变化情况. 附录: 1. 腺病毒使用安全规范 a. 作为一种相对安全的病毒,尽管腺病毒基因组在感染后不会整合进入宿主细胞基因组中,也不会在细胞体内进行复 制,但是仍然具有可能的潜在生物学危险.我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范,并在实验中严格按照本 规范的要求进行操作.更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1,也可以访问如下网页: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL5_sect_IV.pdf. b. 腺病毒操作时应使用相应级别的生物安全柜,不同的腺病毒的生物安全等级会有所不同.如果使用普通超净工作台操 作病毒,请不要打开排风机,以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入. c. 实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩,穿戴实验手套及专门的实验服,避免身体直接接触病毒.手部及面部有开放 性创口时,禁止进行病毒操作.

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40 MOI 碧云天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 C3011 Ad-mCherry-GFP-LC3B

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4 d. 操作病毒时需小心谨慎,不要产生气雾或飞溅.如果操作时........