PDF《马赟 1,蔡静 1,张园娇 1,纪乐军 2,陈建伟 1**,李祥 1》

・2154・ UFLC-QTRAP-MS/MS 法测定绞股蓝中

10 个核苷类成分 * 马S

1 , 蔡静

1 , 张园娇

1 , 纪乐军

2 , 陈建伟 1** , 李祥

1 (1.

南京中医药大学药学院, 南京 210023;

2. 江苏神华药业有限公司, 淮安 211600) 摘要 目的: 建立 UFLC-QTRAP-MS/MS 的方法, 同时测定不同产地绞股蓝及其商品药材中

10 个化合 物 (胸苷、 尿苷、 腺苷、 肌苷、 2′ - 脱氧鸟苷、 鸟苷、 腺嘌呤、 次黄嘌呤、 尿嘧啶、 鸟嘌呤)的含量.方法: 采用XBridge Amide 色谱柱(2.1 mm*100 mm, 3.5 μ m) , 以0.2% 甲酸水溶液(A) -0.2% 甲酸乙腈溶液(B)为流动相, 0.6 mL・min-1 流速梯度洗脱, 正离子 (ESI+)模式下多反应监测 (MRM)检测.结果: 尿 嘧啶、 胸苷、 尿苷、 次黄嘌呤、 肌苷、 2′ - 脱氧鸟苷、 腺苷、 鸟苷、 腺嘌呤、 鸟嘌呤的线性范围分别为 1.97~

3 936.

00、 2.00~200.

00、 30.48~3 048.

00、 19.84~1 984.

00、 10.16~1 016.

00、 4.95~990.

00、 19.72~1 972.

00、 14.70~

2 940.

00、 1.96~196.

00、 14.76~1 476.00 ng・mL-1 (r >

0.997 3) , 平均加样回收率为 99.3%~101.3%, 含量分别 为181.54~1 604.

95、 0.00~216.

45、 63.65~1 093.

17、 3.48~555.

12、 0.07~215.

66、 0.00~171.

65、 0.00~338.

63、 24.67~966.

08、 0.37~140.

07、 14.89~830.79 μ g・g-1 , 绞股蓝中以尿嘧啶、 尿苷、 鸟苷、 鸟嘌呤含量较高;

不同产 地及商品药材中

10 个成分含量有所差异.结论: 该方法为绞股蓝药材内在质量的综合评价提供新的科学 依据. 关键词: 绞股蓝;

药食同源;

胸苷;

尿苷;

腺苷;

肌苷;

2′ - 脱氧鸟苷;

鸟苷;

腺嘌呤;

次黄嘌呤;

尿嘧啶;

鸟嘌 呤;

高分离度快速液相色谱质谱联用 中图分类号: R

917 文献标识码: A 文章编号: 0254-1793 (2017) 12-2154-08 doi: 10.16155/j.0254-1793.2017.12.05 Determination of

10 nucleosides in Gynostemma pentaphyllum by UFLC-QTRAP-MS/MS* MA Yun1 , CAI Jing1 , ZHANG Yuan-jiao1 , JI Le-jun2 , CHEN Jian-wei1** , LI Xiang1 (1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;

2. Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co., Ltd., Huaian 211600, China) Abstract Objective: To establish a method for simultaneous determination of

10 components (thymidine, uridine, adenosine, inosine,

2 ′ -deoxyguanosine, guanosine, adenine, hypoxanthine, uracil and guanine) in Gynostemma pentaphyllum from different habitats and commercial sources by ultra-fast liquid chromatography tandem combined * 江苏省科技成果转化项目 (BA2014118) ;

江苏高校优势学科建设工程资助项目 (PAPD) ** 通信作者 Tel: (025) 85811280;

E-mail: chenjw695@126.com 第一作者 Tel: (025) 85811280;

E-mail: myunok@163.com ・2155・ with triple quadrupole mass spectrometry (UFLC-QTRAP-MS/MS) . Methods: The analysis was carried out on an XBridge Amide column (2.1 mm*100 mm, 3.5 μm) which was eluted by a mobile phase of 0.2% formic acid - 0.2% formic acid in acetonitrile at a flow rate of 0.6 mL・min-1 . The target compounds were analyzed by the positive ion multiple reaction monitoring (MRM) mode. Results: Uracil, thymidine, uridine, hypoxanthine, inosine, 2′ -deoxyguanosine, adenosine, guanosine, adenine and guanine showed good linearity (r >

0.997 3) in the range of 1.97-3 936.00 ng・mL-1 , 2.00-200.00 ng・mL-1 , 30.48-3 048.00 ng・mL-1 , 19.84-1 984.00 ng・mL-1 , 10.16-1 016.00 ng・mL-1 , 4.95-990.00 ng・mL-1 , 19.72-1 972.00 ng・mL-1 , 14.70-2 940.00 ng・mL-1 , 1.96- 196.00 ng・mL-1 and 14.76-1 476.00 ng・mL-1 , respectively. The average recoveries of the ten components were between 99.3% and 101.3%. The contents of ten components were in the range of 181.54-1 604.95μ g・g-1 , 0.00- 216.45 μg・g-1 , 63.65-1 093.17 μg・g-1 , 3.48-555.12 μg・g-1 , 0.07-215.66 μg・g-1 , 0.00-171.6

5 μg・g-1 , 0.00-338.63 μ g・g-1 , 24.67-966.08 μ g・g-1 , 0.37-140.07 μ g・g-1 and 14.89-830.79 μ g・g-1 , respectively. The contents of uracil, uridine, guanosine and guanine were higher in Gynostemma pentaphyllum. The contents of ten components varied by habitats and commercial sources. Conclusion: The established method provides scientific basis for the comprehensive quality evaluation of Gynostemma pentaphyllum. Keywords: Gynostemma pentaphyllum;

homology of medicine and food;

thymidine;

uridine;

adenosine;

inosine;

2′ -deoxyguanosine;

guanosine;

adenine;

hypoxanthine;

uracil;

guanine;

UFLC-QTRAP-MS/MS 绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 的全草, 始载于 《救荒 本草》 , 又名 七叶胆 五叶参 小苦药 等, 广泛分 布于陕西、 山西和长江以南各地[1] , 是一类 药食同 源 类植物资源. 绞股蓝性寒, 味甘苦, 长于补气养阴、 清肺化痰、 养心安神, 其应用日趋广泛, 多被开发成保健品或药 品, 如治疗高脂血症的绞股蓝颗粒、 绞股蓝口服液[2-3] . 核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元 素, 参与 DNA 代谢过程, 具有抗肿瘤, 抗病毒、 免疫 调节、 改善心脑血管循环、 抑制神经递质释放等作用. 目前在绞股蓝的质量评价方面多以皂苷、 黄酮等类 成分为主要考察指标[4-6] , 关于核苷类成分的含量测 定, 笔者尚未见报道. 目前, 核苷类化合物的定量方法主要有高效液 相色谱法 (HPLC 法) 、 毛细管电泳法 (CE 法) 、 液相 色谱-质谱联用技术(LC-MS 法)等[7-9] .HPLC 法难以解决组分共流出现象, 而CE 法的定量检 测重现性又相对较差.高分离度快速液相色谱质 谱联用(UFLC-QTRAP-MS/MS)技术具有灵敏度高, 选择性强, 定量准确, 分析速度快等优点.因此, 本实验采用 UFLC-QTRAP-MS/MS 技术建立同 时测定

10 个分析物 (6 个核苷: 胸苷、 尿苷、 腺苷、 肌苷、 2′ - 脱氧鸟苷、 鸟苷和

4 个碱基: 腺嘌呤、 次 黄嘌呤、 尿嘧啶、 鸟嘌呤)的分析方法, 以期为绞 股蓝的内在质量的综合评价和全面控制提供科学 依据.

1 仪器与试药 1.1 仪器 AB Sciex QTRAP

5500 质谱仪 (ABSciex 公司) ;

LC-20A 快速液相仪 (配有 DGU-20A3 在线脱气机、 LC-20ADXR 泵、 SIL-20AXR 自动进样器及CTO- 20AC 柱温箱, Shimadzu 公司) ;

Waters 公司 XBridge Amide 氨基色谱柱 (2.1 mm*100 mm, 3.5 μm;

基质: 基于亚乙基桥杂化颗粒 (BEH) 的三键键合酰胺基) ;

KH-500DB 型数控超声波清洗器 (500 W, 昆山禾创 超声仪器有限公司) ;

Sartorius BT125D 十万分之一电 子天平和 ME36S 型百万分之一电子天平 (Sartorius 公司) ;

TGL-16B 型离心机(上 海安亭科学仪器厂) . 1.2 试药 对照品腺嘌呤(批 号110886-200001) 、 尿嘧啶(批 号100469-200401) 、 鸟嘌呤(批 号140631- 200904) 、 腺苷(批 号110879-200202) 、 肌苷(批 号140669-201104)和尿苷(批 号110887-200202)均 购于中国食品药品检定研究院 (纯度均>

98%) , 次 黄嘌呤 (批号 B20211, 纯度>

98%) 购于源叶生物科 技有限公司, 胸苷 (批号 1001182663) 、 2′ - 脱氧鸟苷 ・2156・ 表1样品信息 Tab.

1 Sample information 样品编号 (sample No.) 产地 (habitat) 批号 (batch No.) 类型 (category) S1 陕西 (Shaanxi)

20150426 饮片 (decoction pieces) S2 江苏 (Jiangsu)

20141101 饮片 (decoction pieces) S3 山西 (Shanxi)

20140301 饮片 (decoction pieces) S4 湖北 (Hubei)

20150201 饮片 (decoction pieces) S5 江苏 (Jiangsu)

20150629 饮片 (decoction pieces) S6 安徽 (Anhui)

20140501 饮片 (decoction pieces) S7 安徽 (Anhui)

20140501 饮片 (decoction pieces) S8 湖南 (Hunan)

20150109 饮片 (decoction pieces) S9 广西 (Guangxi)

20151101 饮片 (decoction pieces) S10 安徽 (Anhui)

20141201 饮片 (decoction pieces) S11 安徽 (Anhui)

20150801 饮片 (decoction pieces) S12 湖南张家界 (Zhangjiajie, Hunan) 实地采集 (collected in field) 原药材 (crude drug) S13 江苏苏州 (Suzhou, Jiangsu) 实地采集 (collected in field) 原药材 (crude drug) S14 湖北罗田 (Luotian, Hubei) 实地采集 (collected in field) 原药材 (crude drug) S15 贵州遵义 (Zunyi, Guizhou) 实地采集 (collected in field) 原药材 (crude drug)

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液 分别精密称取胸苷、 尿苷、 腺苷、 肌苷、 2′ - 脱氧鸟苷、 鸟苷、 腺嘌呤、 次黄嘌呤、 尿嘧啶、 鸟嘌呤的对照品适量, 加纯化水超声助溶, 制成质量浓度分别为 100.

00、 101.

60、 98.

60、 99.

20、 99.

00、 98.

00、 98.

20、 99.

20、 98.

40、 98.40 μg・mL-1 的 各对照品储备溶液;

取各对照品储备液适量, 加纯 化水定容至

100 mL 制成混合对照品溶液, 其中各成 分浓度分别为

3 936.

00、 200.

00、

3 048.

00、

1 984.

00、

1 016.

00、 990.

00、

1 972.

00、

2 940.

00、 196.

00、

1 476.00 ng・mL-1 , 并逐级梯度稀释, 得到

5 种系列浓 度的混合对照品溶液, 用于建立回归方程及线性范围 检测. 2.1.2 供试品溶液 取使用石油醚脱脂后的绞股蓝 粉末 1.0 g, 过60 目筛, 精密称定, 置于

50 mL 具塞锥 形瓶中, 精密加入超纯水

20 mL, 室温下超声 (50 W,

40 kHz) 处理

60 min, 过滤, 滤液以

12 000 r・min-1 离心, 取上清液, 过0.22 μ m 滤膜, 即得供试品溶液. 2.2 分析条件 2.2.1 色谱条件 采用 Waters XBridge Amide 氨基色 谱柱 (2.1 mm*100 mm, 3.5 μm) , 以0.2% 甲酸水溶液 (A) -0.2% 甲酸乙腈 (B) 为流动相, 0.6 mL・min-1 流........