PDF《付再萍》

第6卷第

2 期2007 年3月杭州师范学院学报(自然科学版) Journal of Hangzhou Teachers College(Natural Science Edition) Vol .

6 No .

2 Mar .2007 收稿日期 : 2007\03\01 基金项目 : 浙江省自然科学基金项目(Y506225) . 作者简介 : 付再萍(1981 ― ) , 女,浙江台州人 , 生态学专业硕士研究生 , 主要从事植物生态学研究 . 文章编号 :

1008 - 9403(2007)02 -

0129 -

04 狗脊 蕨(Woodwardia j aponica(L .f . ) Sm)基因 组DNA 提取 与随 机扩增多态性 DNA(RAPD)的优 化 付再萍 (杭州师范大学 生命与环境科学学院 , 浙江 杭州 310036) 摘要:以狗脊蕨新鲜叶片为材料 , 使用改良的 CTAB 法提取其基因组 DNA , 通过单因子实验优化了各反应 物的浓度 , 即在

25 μL 总反应体系 , Mg2 + (2 .

5 mmol/L) , dNTPs(200 mmol/L) ,DNA(15 ng) ,Taq 酶(1 .

5 U) , 引物 (0 .

15 μmmol/L) , 扩增程序为 :

94 ℃ 预变性

1 min , 然后

94 ℃ 变性

1 min ,

39 ℃ 退火 1min ,

72 ℃ 延伸

2 min ,

40 个 循环 , 最后

72 ℃ 延伸

10 min ,

4 ℃ 保存 . 狗脊 RAPD 条件优化为分析狗脊蕨的遗传多样性打下稳定的基础 . 关键词 :狗脊蕨 ;

RAPD ;

条件优化 中图分类号 :Q943 文献标志码 :A 随机扩增多态性 DNA (random amplified polymorphisimic DNA ,RAPD)是1990 年由美国科学家 Williams 和Welsh 采用 PCR 技术发展起来的一种 DNA 分子标记技术 , 具有操作简单快捷 、 成本低 、 通用 性好 、 灵敏度高且不需预先了解基因组的相关分子生物学信息等优点而广泛应用于种质资源分析 、 生物种 群划分 、 遗传相关分析 、 遗传图谱构建 、 基因定位 [1\4] 等方面 . 在此采用 RAPD 分子标记对广布于浙江森林 草本层中的狗脊遗传多样性进行研究 , 由于 RAPD 本身具有稳定性和重复性差的缺点[5\8] , 为此优化了狗 脊的基因组 DNA 提取方法和 RAPD 反应体系 , 以期建立一个稳定的反应体系克服这一缺点 , 也为今后狗 脊蕨在各个演替阶段的遗传多样性分析提供最基本的保障 .

1 材料和方法

1 .

1 植物材料 狗脊嫩叶采自于浙江宁波天童国家森林公园 , 放入封口袋中 , 冰壶保存 , 硅胶快速干燥后带回实验室 内,贮存于 -

70 ℃ 的超低温冰箱中 .

1 .

2 狗脊基因组 DNA 提取及检测

1 .

2 .

1 狗脊基因组 DNA 提取(改良的 CTAB 法) 取新鲜叶子

1 g 左右 , 加入适量液氮研磨 , 转移至

65 ℃ 预热的

650 μl2% CTAB 提取液中(2% CTAB ;

1 .

4 mol/LNaCl ;

20 mmol/L EDTA (pH

8 . 0) ;

100 mmol/L Tris\HCl (pH

8 . 0) ;

2% (V /V )的β\巯基乙 醇) ,

65 ℃ 水浴

1 h , 期间每隔几分钟摇动一次 ;

1 h 后,加入

650 μl 氯仿和异戊醇混合液(体积比

24 : 1) , 振 荡摇匀 ,

4 ℃

10 000 * g 离心

10 min ;

取上清液

400 μl 转至另一干净 eppendorf 管中 , 再加入

400 μl 的氯仿 和异戊醇的混合液(体积比

24 : 1) , 振荡摇匀 ,

4 ℃

10 000 * g 离心

10 min ;

取上清液

350 μl 至另一

1 .

5 ml 管中 , 加2倍体积的无水乙醇 , 上下轻轻颠倒混匀 , 发现有白色絮状沉淀出现 , 冰浴

20 min ;

4 ℃

8 000 * g 离心

5 min , 弃上清 , 用70% 酒精清洗

1 次;

200 μlTE 溶解 , 加同体积的氯仿和异戊醇的混合液(体积比

24 : 1) , 重复一次 . 最后用

200 μlTE 溶解 , 放在 -