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2 2 一第l4卷第4 期I999年 l 2月中国病毒学VI ROL oGJ CA S I N I CA Vo I .

14 N0.

4 Dee.

1 999 肾综 合征 出血 热病 毒R2 2株核蛋白基 因的克隆 、 尺.竹序列分析 及其表达 R 神2一剪 姚智慧董关俞永 新(中国药 品生物材 品幢 定所. 北京 l O ~5 o ) 摘要为研 究肾综 合征 出血 热旃 毒疫 苗侯选株R22校 蛋白的结 构 与特 性,应用 逆转录PCR扩 增了R22编 码 区基 因, 并将 扩增 产物 克隆 于pET-3a表 达 质粒 . 测得R22株 s片段 编码区序 列为1290个核苷酸 . 比较分 析表 明与 S e o l d型 同源性 高选

9 6

2 %. 而与 ] ~n t a a n型 同源性 仅为

7 1 . O %. 与 用血清 学分 型的 结果 一致 .将 克隆的 p E T- R

2 2 NP转 化到 B L

2 1后.IPTG诱 导 得到 较高敛的表达,产物纯化后进 行We s t e r n b l o t 分析, 结果表达的 N P仅与NP蛋 白特 异的 单克隆抗 体A35和

3 1

3 9反应 . 而与G2蛋 白特异 的3138不 反应 .表 达的产 物为祝 坦病 毒 的诊断提 供 了特 异性 抗原 . 关键词 肾综台征出血热府毒, 整置 基璺直匿. 庄到盐堑 蠢垫 .Hr K y 肾综合 征出血热是 由布尼亚病 毒科汉坦病 毒属引起的 、 临床上 以发热 、 出血及 肾损害 为基 本 特征的一类 疾病

1 .汉 坦病 毒具有单股 负链 RN A组,分L、 M、 S 3个 片段 , 分别 编码病 毒的 多聚酶 , 包膜蛋 白和 核蛋白2-51.研 究表 明, 3个蛋白中 以NP含量 为高 , 免疫原性 强【

8 1 . 为研 究NP蛋 白的结构与特性 , 应 用带有 T 7噬菌体 启动 子的 p E T .

3 a 表达 质粒 对我 国疫苗 侯选株R22株的 S基因进行克隆 、 测 序分析 , 并在大肠 杆菌中获得较高效 的表达 .

1 材料和方法

1 .

1 菌种 和质 粒pET-

3 a 质粒 和BI21 宿 主菌均 为Stratagene公司产 品.

1 .

2 V e t o - E 6细胞来自ATC C . 由我 室传 代保 存.病 毒在 Ve t o - E 6缅 胞上感 染7―1

0 d左右 收获. 漓 度大 于lo'

PFU/ mL .

1 .

3 R

2 2 毒株 从河南省新安县疫区褐家鼠组织分离 】 . V e t o - E 6细胞传代, 一7

0 ℃保存 .该毒株经交叉中 和试 验 .和交 叉保 护力 试验 … 表 明具有教 广谱 的抗 原特性 .

1 .

4 RN A提取 应 用热 酚异硫 氰酸 弧法 , 参 见文献 【 I

2 ] .

1 . s

5 l 物 的设 计与 台成 参照肾综 合征 出血 热标 准株7

6 -

1 1 8的 序列 【 j 】 . 设计带有 E c o RI和BII酶切位点的引物 3条.在ABI的DN A合 成仪 上合成 , 用异 丁醇提 取纯化 . P

1 :T A GT AG TA GA r (

1 c C TA ( 卜一l

7 ) P

2 :C C AG AT cT A T GG C AA T G GA G (

3 7 ~5

1 ) P

3 :G GAA TTC rr AG AG TT T C AA A GG (

1 3

2 6 ~1

3 1

2 )

1 .

6 e DN A合成 殛冀式 P CR 将提 取 的总 R NA加40u的 AMV 逆转 录酶 和1L的 随机 引物 .

4 2℃逆转录2h.然后 以Pl,P3为 引物 ,

9 2℃

2 r ai n .

4 2℃ 2r ai n ,

7 2 ℃

3 r ai n . 1十 循环 后.92℃

3 0 s ,

4 2℃

1 r ai n ,

7 2℃

1 mi n , 收稿 日期 :

1 9

9 8 ~1

1 ―1

3 、 妊回日期 :

1 9

9 9 一~1

6 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 姚智慧等 : 肾综 合征 出血热病 毒R22株桉 蛋 白基 因的克 隆、序列分 折及 其表 达32330个 循环 . 最后延伸 7m[ n .扩增的产物 再以P2.P3为 引物 进行 巢式 P C R. 条件同上 .

1 .

7 扩增DN A的纯 化、酶切殛 克隆 将扩增的产物 在0.8%Agarose凝 畦上电泳 回收 , 用BIO101公 司的Ge m e c l e a n Ⅱ k i t 纯 化后 , 再甩EcoRI和BglⅡ酶切消化 并纯 化;