PDF《产品信息和操作指南》

8 基之后)就是为了充分混合培养基与冻存液,这两步不能省略. 此外,颠倒混匀的时候,不可用力猛摇,被DMSO浸润的细胞, 细胞膜非常脆弱,容易破裂. 细胞存活率与恢复率 细胞冻存复苏的质量可以通过存活率(viability)来衡量.即 在细胞复苏、洗涤之后,用台盼蓝进行细胞计数.存活率 = 活细 胞数 / 细胞总数 * 100%.经台盼蓝染色,活细胞呈无色,晶莹 透亮;

死细胞呈蓝色,暗淡无光. 一般来说, 如果细胞的存活率低于70%, ELISPOT检测结果会 很糟糕.补救的办法是让细胞休息过夜,让进入凋亡程序的细胞 有时间死亡,之后ELISPOT检测结果会有所改善.如果细胞的存 活率高于80%就会获得较满意的ELISPOT检测结果. 如果严格按本 实验规范,可以保证存活率达到90%.在此存活率下,复苏的细胞 可以直接做ELISPOT检测,不需要休息过夜. 与存活率相关联但又有显著区别的另一个概念是恢复率 (recovery).恢复率是指冻存、复苏之后回收到的活细胞和冻存 前活细胞的比例.恢复率的高低取决于两个影响因素,即存活率 和洗涤丢失比例.使用本试剂盒,细胞的存活率很高,它对恢复 率的影响可以忽略.所以对恢复率的主要影响因素是洗涤过程中 细胞的丢失. 本操作手册中有两步洗涤, 都在15mL离心管内进行, 推荐的离心条件是250g和10分钟,按照这种操作,细胞的丢失应 该在可接受的范围之内.如果觉得细胞丢失严重,可以将离心离 加大到400g,时间延长到15-20分钟.同时我们推荐较高的细胞冻 存浓度,即1*107 /mL,甚至可以更高.如果细胞达不到这种浓度, 也至少应该达到5*106 /mL.

9 DMSO 达优? 重悬液不含DMSO,达优? 2X冻存液含有DMSO.由于 DMSO对细胞有毒性, 所以在涉及DMSO的操作步骤上, 时间要尽 可能短,以便减轻DMSO对细胞的损害.另外,低温条件时,细 胞的生命活动弱,对DMSO的耐受程度高,所以要严格注意冰上 操作.在随后的洗涤步骤上,要洗涤干净,尽可能减少残留的 DMSO对细胞的伤害. 暴露给DMSO时间的长短和剂量的高低将影 响细胞的功能和存活率,从而在ELISPOT中引入不确定因素.所 以要注意这些操作步骤的规范化和标准化,减少不确定因素的干 扰. 实例: 冻存、复苏之后的人 PBMC,没有休息过夜,直接进行 ELISPOT 检测.均是直接孵育法,孵育

18 小时,无血清培基,人IFN-γ ELISPOT 试剂盒. 左图,负对照,20 万/孔;

右图,CEF 刺激,20 万/孔. 实验记录 11 ........