PDF《ASO 使用说明书》

37 ℃的CO2 培养箱中培养 24~96h(培养时间不实验目的相关). 电话咨询:

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邮箱:customer-care@ribobio.com 表2使用 riboFECT? CP 转染 ASO 用量参考 v1: 细胞培养基 ;

v2 : 1X riboFECT? CP Buffer;

v3 : 20μM ASO;

v4 : riboFECT? CP Reagent siRNA 终浓度 每孔体积 培养基(v1) Buffer(v2) ASO(v3) Reagent(v4) 96-well 100nM 100μl 92.90μl 6μl 0.5μl 0.6μl 50nM 100μl 93.15μl 6μl 0.25μl 0.6μl 30nM 100μl 93.25μl 6μl 0.15μl 0.6μl 20nM 100μl 93.30μl 6μl 0.1μl 0.6μl 10nM 100μl 93.35μl 6μl 0.05μl 0.6μl 24-well 100nM 500μl 464.50μl 30μl 2.5μl 3μl * 50nM 500μl 465.75μl 30μl 1.25μl 3μl 30nM 500μl 466.25μl 30μl 0.75μl 3μl 20nM 500μl 466.50μl 30μl 0.5μl 3μl 10nM 500μl 466.75μl 30μl 0.25μl 3μl 12-well 100nM 1ml 929.00μl 60μl 5μl 6μl 50nM 1ml 931.50μl 60μl 2.5μl 6μl 30nM 1ml 932.50μl 60μl 1.5μl 6μl 20nM 1ml 933.00μl 60μl 1μl 6μl 10nM 1ml 933.50μl 60μl 0.5μl 6μl 6-well 100nM 2ml 1858.00μl 120μl 10μl 12μl 50nM 2ml 1863.00μl 120μl 5μl 12μl 30nM 2ml 1865.00μl 120μl 3μl 12μl 20nM 2ml 1866.00μl 120μl 2μl 12μl 10nM 2ml 1867.00μl 120μl 1μl 12μl *: 实验参考用量示例, 对于部分细胞类型需要一步优化. 3) 效果检测 转染完成后 24~72 小时均可行 ASO 沉默效果检测,最佳检测时间不细胞类型,转染试 剂,检测目的等相关. a. RNA 水平的检测:ASO 作用的目标分子是目的基因的 RNA,其涉及 RNase-H 介导的靶 RNA 裂解 ,故检测目的基因的 RNA 水平可直接反应 ASO 是否Щ恿讼嘤Φ淖饔,且通 过qRT-PCR 可计算具体的抑制效率.一般 ASO 转染后 24~72h 即可检测到目的基因 RNA 表达明显降低.注:引物设计质量很重要 . b. 蛋白水平的检测:对于蛋白编码基因,还需检测相应的蛋白表达水平,以确定是否目的蛋 白也成功下调.由于蛋白表达水平的变化受多个因素影响,有时候会出现 RNA 水平成功 抑制了而蛋白水平变化丌明显的情况.若蛋白表达水平下降丌明显,需认真检测其 mRNA 的表达水平,用于判断 ASO 丌理想的原因. c. 功能筛选:应用 EdU 细胞增殖、TUNEL 细胞凋亡等检测方法行 ASO 对细胞功能的直 接筛选. 电话咨询:

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邮箱:customer-care@ribobio.com 动物实验方法 动物模型:根据实验需要选择合适的动物模型. 修饰方式:锐博生物经过多年研,开С隽烁呶榷ㄐ缘 ASO 化学修饰方案,合成的 ASO 可 直接用于动物实验. 给药方式: 1. 局部给药,最直接的导入方式局部给药,ASO 的导入效率较高, 用量少,ASO 能很快被吸 收.适用于浅表器官和组织,包括眼、肌肉、皮下组织等. 2. 系统给药:一些无法通过局部给药方式到达的靶位,如内脏,器官以及一些散列分布的靶位 (如淋巴细胞、转移性肿瘤细胞等),可使用系统性注射方式,包括心、肝、脾、肺、肾等. 相关产品 产品编号 产品名称 C10511-05 riboFECTTM CP Transfection Kit(166T) C10511-1 riboFECTTM CP Transfection Kit(333T) C10410-1 riboMONITORTM Transfection Indicator Kit(Green),20T 电话咨询:

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邮箱:customer-care@ribobio.com 实验指南 1. 实验对照该如何设置? 正式实验为实验组和阴性对照组(a-b),实验组的抑制效果均需不NC组比较. 在预实验中设置对照组(c-d),以确认转染试剂及阴性对照无毒副作用,且对基因沉默检 测指标无显著干扰影响. 如果对实验细胞转染效率丌甚了解,则需要在预实验中设置对照组(d)行转染效率检测, 以确定适合的转染试剂及转染条件. 常用对照组列表: a) 实验组:使用目的基因ASO 行转染. b) 阴性对照组(NC组):使用阴性对照ASO行转染,用于说明ASO作用的特异性,作为 分析目的基因ASO作用的参照. c) 正常细胞对照组(Blank组):未经任何转染处理的细胞,用于观测整个实验过程细胞的 生长状态及分析的参考. d) 转染试剂对照组(Mock组):使用转染试剂行转染,但丌加入ASO,用于排除转染试 剂对细胞可能的影响及分析参考. 2. 基因沉默效果不好,该如何改善? 1)提高转染效率 成功的转染是RNAi实验的前提.若基因沉默效果丌佳,则需先排查转染效率方面的问题. 首先可依据转染试剂说明书行转染条件(细胞密度,转染试剂用量,转染时间等)优化尝试, 其次可尝试在其他细胞类型上行转染.若由于实验模型限制无法使用其他细胞,可考虑更换 转染试剂或转染方法(如电转). 2)检测目的基因表达水平 若目的基因在实验细胞中的表达丰度很低,是难以得到有效的沉默的.一般目的基因不 GAPDH或ACTB的ΔCt值为10以内,比较适合做RNAi,若ΔCt值达到15以上则无法得到有效的 沉默效果.对于目的基因表达丰度低的情况,建议更换实验细胞. 3)优化ASO浓度 ASO在一定的丰度下才能达到理想的作用效果,故可根据锐博生物的推荐浓度(50nM) 行预实验测试,再结合实验细胞系类型及目的基因的表达水平设置ASO浓度梯度来优化ASO最 适浓度. 4)更换其他ASO 若确定转染效果尚佳,其他因素也分析没有问题的情况下,却没有达到理想的基因沉默效 果,则可以尝试更换其他ASO来测试.由于RNA本身序列特性,或者靶位点的二级结构复杂等 因素,有些ASO的基因沉默效果可能没有那么显著,这种情况下可以尝试更换ASO. 5)检测分析方法有误 引物使用有误,检测时间点设置丌合理,对照样本异常,实验样本检测数据丌稳定等因素 都会对后期实验数据分析造成影响,此类问题需根据具体的问题有针对性地行分析调整. 6)其它原因 如目的基因的表达调控特性导致其难以沉默,已排除转染方法,转染效率,基因表达水 平及ASO浓度等方面的问题,则应考虑更换细胞行尝试. ........