PDF《注意事项》

注意事项 1.

匀浆后,加氯仿前,样品可在-70℃ 放置一个月. 2.RNA沉淀可以保存在75%乙醇中,2-8℃一个星期以上或-20℃一年. 预防RNase污染,应注意以下几方面: 1.经常更换新手套.因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染. 2.使用RNase-Free的塑料制品和枪头避免交叉污染. 3.RNA在TRNzol Universal试剂中时不会被RNase降解.但提取后继续处理过程中应使用 RNase-Free的塑料和玻璃器皿.玻璃器皿可在150℃烘烤4h,塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase. 4.配制溶液应使用RNase-Free ddH2O.(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓 度0.1%(V/V,放置过夜,高压灭菌). RNA提取操作步骤 准备试剂:氯仿、异丙醇、RNase-Free ddH2O 、75%乙醇(使用RNase-Free ddH2O 配制). 1. 样品处理 a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接 在TRNzol Universal试剂中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1 min.大约100 mg叶 片使用1 ml TRNzol Universal试剂. b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每30-50 mg组织加入

1 ml TRNzol Universal试剂,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过TRNzol Universal试剂体积的10%. c. 单层培养细胞:单层贴壁细胞的收集(收集细胞数量请不要超过1*107 ):可直接在 培养容器中裂解(容器体积不超过10 cm2 ),或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉 淀.(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法). 1) 直接裂解法: 直接在培养板中加入TRNzol Universal试剂裂解细胞,每10 cm2 面积加入1 ml TRNzol Universal试剂.用取样器吹打几次.注意:TRNzol Universal试剂加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果TRNzol Universal试剂加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染. 2) 胰蛋白酶处理法:确定细胞数量,吸除培养基,用PBS洗涤细胞,吸除PBS,向 细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞,当细胞脱离容器壁时,加 入含有血清的培养基失活胰蛋白酶,将细胞溶液转移至RNase-free的离心管中, 300*g离心5 min,收集细胞沉淀,仔细吸除所有上清. 注意:收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则会导致裂解不完全,造成RNA 的产量降低. d. 细胞悬液:离心取细胞.每5*106 -1*107 动物细胞和植物细胞加入1 ml TRNzol Universal试剂.加入TRNzol Universal试剂前不要洗涤细胞,以免降解mRNA. e. 血液与病毒液处理:直接取新鲜的血液或病毒液,加入3倍体积TRNzol Universal试剂 (推荐0.2 ml全血或病毒液加入0.6 ml TRNzol Universal试剂),充分振荡混匀. 2. 将匀浆样品在室温放置5 min,使得核酸蛋白复合物完全分离. 3. 可选步骤:4℃ 12,000 rpm(~13,400*g) 离心10 min,取上清. 注意:如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除. 离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA.处理脂肪组 织样品时,上层是大量油脂,应除去.取澄清的匀浆溶液进行下一步操作. 4. 每使用1 ml TRNzol Universal试剂加0.2 ml氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15 sec,室温放置

3 min. 注意:如不能旋涡混匀,可手动快速颠倒混匀2 min 5. 4℃ 12,000 rpm(~13,400*g)离心15 min.样品会分成三层:粉色的有机相,中间层和上 层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约500 μl)转移到新的离心管中.(如果要 分离DNA和蛋白质,可向天根公司索取提取方法). 6. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇,混匀,室温放置10 min. 7. 4℃ 12,000 rpm(~13,400*g)离心10 min,去上清.离心前RNA沉淀经常是看不见的,离 心后在管侧和管底形成胶状沉淀. 8. 加入1 ml 75%乙醇(用RNase-free ddH2O配制)洗涤沉淀.每使用1 ml TRNzol Universal 试剂至少用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤. 9. 4℃ 10,000 rpm (~9,391*g) 离心5 min.倒出液体,注意不要倒出沉淀,剩余的少量液 体短暂离心,然后用枪头吸出,注意不要吸弃沉淀. 10. 室温放置晾干(不要晾的过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3 min左右即 可),根据实验需要,加入30-100 μl RNase-Free ddH2O,反复吹打、混匀,充分溶解 RNA. 不同组织或细胞RNA提取预期得率 植物叶片 100C500 μg/g 叶片 动物组织 6-10 μg/mg 肝脏组织 动植物培养细胞 5C10 μg/106 细胞 血液 3C5 μg/ml 人类全血 问题指南低得率 A.样品裂解或匀浆处理不彻底. B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解. A260/ A280