PDF《王增福 , 崔治中3 3 , 张志,吴永平》

2002 A PS ? Many small tumor spots + + in liver and spleen SD0301

2003 A PS

42 Many small tumor spots + + in liver and spleen HB0301

2003 B PS

36 Many small tumor spots + + in liver and spleen BJ0301

2003 B PS ? Many small tumor spots + + in liver and spleen BJ0302

2003 B PS ? No typical lesion + + BJ0303

2003 B PS ? No typical lesion + + Company A ,B and C were according to the clear background history ;

Company A ? and B ? were assumed origin , according to both gp85 and 3′ 2L TR deletion analysis Cb = Commercial broilers ;

PS = Parent stocks

4 9

3 中国病毒学第20 卷?1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.

2003 年则采用下列方法分离毒株 :将送检病鸡 无菌抗凝采血 ,2000r/ min

4 ℃ 离心 5min ,取白细胞 接种到已长成单层的 CEF.病毒接种细胞后 ,让病 毒吸附 3h ,将培养基换成血清浓度为

1 %的维持液 , 放置在

37 ℃CO2 浓度为

1 %的细胞培养箱内培养 , 病毒增殖 5d 后 ,将其消化传到

96 孔细胞板上 ,继续 培养 5d 用于间接免疫荧光试验. 1.

4 间接免疫荧光试验(IFA) 细胞在

96 孔细胞培养板上培养 5d 后 ,收获病 毒后 ,用PBS 洗涤两次 ,然后用丙酮2乙醇 (6 ∶ 4) 固 定液于

37 ℃ 恒温箱中固定 10min ,再用 PBS 洗涤

2 次 ,干燥后进行 IFA .96 孔细胞培养板上分别加入 ALV2J 特异性单抗JE9[11 ] (

1 ∶500 稀释,为抗ALV2J GP85 的特异性单抗) ,37 ℃反应 45min ,弃 去一抗 ,用PBS 洗涤三次 ,再加入 FITC 标记的羊 抗鼠荧光抗体 (购自 SIGMA 公司 ,1 ∶160 稀释) ,

37 ℃ 反应 45min ,弃去二抗 ,用PBS 洗涤三次 ,置荧 光显微镜下观察. 1.

5 特异性蛋白基因扩增 将病毒增殖 10d 后将细胞消化 ,提取细胞 DNA 用于 PCR 反应的模板. 根据已发表的资料合成一 对扩增 ALV2J 囊膜糖蛋白基因大小约 2. 2kb 的特 异性引物[4 ,12 ,13 ] ,其正向引物

1 的序列为 5′ 2gctgc2 catcgagaggttact23′ ,反向引物

2 的序列为 5′ 2agttgt2 cagggaatcgac23′ . 1.

6 env 基因的克隆 将纯化的 env 基因的 PCR 产物克隆到 pMD182 T 载体中 ,用EcoR I 和Hind III 两种限制性内切酶 鉴定阳性克隆 ,将阳性克隆送交生物公司测序. env 基因序列在 GeneBank 中的序列号分别为 : NX0101 A Y897227 ;

SD0201 A Y897218 ;

SD0301 A Y897228 ;

HB0301 A Y897229 ;

B J0301 A Y897230 ;

BJ0302 A Y897231 ;

BJ0303 A Y897232.

2 结果 2.

1 ALV 2J 中国分离株与原型株的 GP85 氨基酸 序列分析 通过比较

14 个ALV2J 中国分离株与原型株 HPRS2103 的Gp85 蛋白氨基酸序列 (参考序列在 Genebank 中的序列号分别为 : SD9901 A Y897220 ;

SD9902 A Y897221 ;

YZ9901 A Y897222 ;

SD0001 A Y897223 ;

SD0002 A Y897224 ;

SD0101 A Y897225 ;

HN0001A Y897219) ,发现变异分布在整个 GP85 蛋 白上 ,但主要集中在

3 个高变区22hr

1、 hr2 和vr3 上 ,而且 hr2 和vr3 的变异更为明显.这些变异中 除半胱氨酸残基所有的氨基酸残基均发生过变异 , 这是因为半胱氨酸对于维持 GP85 的二级结构起着 很重要的作用.所有变异均没有规律性 ,既看不出 它们与品系的关系 ,也看不出与分离年代的关系. 值得一提的是 ,BJ

0301、 BJ0302 和BJ0303 分离自同 一鸡场 ,但它们却发生了

13 个氨基酸的........