PDF《生物大分子纯化经验问答之三》

生物大分子纯化经验问答之三 韦新桂(Chromatography) 北京韦氏博慧色谱科技有限公司,www.

wsac.cn, weixingui@263.net,感谢丁香园各位战友支持 原链接: http://www.dxy.cn/bbs/topic/1042756 推荐纯化相关的书籍: 《蛋白纯化与实验鉴定指南》 、 《生物工程下游技术》 、 《酶工程》 、 《酶 制剂工业》 《生化实验方法和技术》 , 《蛋白纯化实验指南》 , 《生化制药学》 , 《药物蛋白质分 离纯化技术》 , 《蛋白质纯化技术及应用》 , 《protein purification》等 请教 chromatography 兄: 刚买的 sepharose6B 150mL,这应该是膨胀后的吧?我做实验时就不 用膨胀这一步了是吗?还有应该怎样保存呢?看文献说是加入 0.02%的叠氮化钠, 刚买的用 过一次,剩余的用不用这样保存呢? 对,是已经膨胀后的,通常这个填料保存 20%乙醇即可.仔细看说明书,没有可以问厂家 要,或者参考一些类似的填料即可 chromatography 老师,又有问题请教了.我的葡聚糖凝胶柱用乙醇封柱,再次使用后发现 凝胶柱短了 5mm 左右,不只影不影响处理结果,会不会每封一次柱,都会有所下降.如果 想到希望的柱高度,是不是必须重新灌柱? 这个填料就是容易收缩,不过要只有一点没关系的.收缩多少看你用的什么型号而定,流速 别快,我想从你说的情况看应该没事,继续用吧,有条件还刚性好的琼葡糖凝胶或 superdex 的就不会这么麻烦了. 谢谢 chromatography :原来乙酸铵容易挥发,样品已经冷冻干燥过了,用不着除盐了吧,可是冷 冻干燥后样品不容易溶解.我还有一个问题请教,我们实验室没有电导仪,没有 PH 记, 没有蠕 动泵,我做离子交换只有

2 根2.6/20cm 的柱子,没有这些仪器能行吗,可以到别的实验室去 做,我是想自己能做的话可以经常摸索条件,不用麻烦别人 样品不容易溶解也许还有别的原因,具体情况不很清楚,你可以改变 pH 看看,没设备不大好做, 你只能选择阶段洗脱,靠重力流也可以.没电导是麻烦,但是也可以不用,至于 pH 那你只好用精 密pH 试纸看看了 chromatography 您好.现在我要纯化表达出来的融合蛋白,希望能够得到您的指导.1.表达 的目的蛋白本身的理论 PI=5.76;

因为是融合蛋白,加了 GFPuv,Flag,His6 这些 tag. 所以实际等 电点是不是和表达的目的蛋白理论等电点不同呢?我把整个融合蛋白的氨基酸序列输入到 ExPAsy 中,得到的融合蛋白理论 PI=5.71.2.因为是在昆虫中表达,蛋白存在于体液中,里 面包含了大量的杂蛋白,所以我打算先用硫氨沉淀,然后再选择阴离子交换,最后利用 falg 进行纯化. (周围的很多人说.HIS 纯化不好?) 不知道这样的思路妥当不妥当? 3.关于缓 冲液的选择,硫氨沉淀的缓冲选择,用tris 还是磷酸 buffer 好呢?这是不是要考虑到下一步 的阴离子交换?硫氨沉淀如果选择 tris,PH 多少合适呢? 如果带 his 标签,最好用镍柱去纯化,其实纯化的好坏和填料,样品,用法都有很大的关系,而his 标签还是用的最多的标签,而用 falg 进行纯化比较贵.样品直接上镍柱我觉得更好,常规的方 法更费时间,不推荐 请问楼主 ACA 填料是由何成分组成的,可以自己做吗? 全名叫 Ultrogel? AcA 系列填料,是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺混合的凝胶,自己难做.用别的凝 胶过滤代替也可以如琼葡糖凝胶或 superdex 有一个问题想请教,也困扰很长时间了, 就是我在做一个重组蛋白的纯化,是生产规模的, 先后经过了 Phenyl 疏水层析,Q sepharose FF 离子交换,superdex