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BOSTER 博士德生物 Product Information 地址:武汉市关山二路特一号国际企业中心

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电话:800-880-8748,(027)67845390/1/2/3/5 传真:(027)67845396

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网址:www.boster.com.cn BOSTER 在/平/凡/中/创/造/奇/迹BOSTER ISH Detection Kit Ⅲ(AP) 通用型原位杂交检测试剂盒Ⅲ(碱性磷酸酶) 产品编号:MK1031 保存:置4℃. 工作量:100 张切片. 有效期:一年. 所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法,在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段.现 在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生,发展和调控等根本性问题的有力工 具,其作用是免疫组化所无法代替的. 博士德专门设计了敏感性加强型原位杂交检测试剂盒. 具有敏感性特高,操作简便和结果准确的优点.该试剂盒分为两种,一种为过氧化物酶检测,一 种为碱性磷酸酶检测系统. 用于 mRNA 的杂交.MK1031 仅适于地高辛高效标记的寡核苷酸探 针,不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高辛的寡核苷酸探针. 如果使用 cDNA 探针,应在杂交之前变性探针. 试剂盒中内容 1.胃蛋白酶(*10;

Pepsin)2ml;

2.寡核苷酸探针杂交稀释液 2ml;

3. 预杂交液 2ml;

4. 封闭液 5ml;

5.碱性磷酸酶标记小鼠抗地高辛 0.1ml 6. BCIP/NBT 0.5ml(*20) ;

7.核固 红6ml;

8 水溶性封片剂:6ml. 用户自备试剂:原位杂交专用盖玻片(博士德有售) ;

POLY-L-LYSINE;

DEPC;

20%甘油 缓冲液(3%柠檬酸,2*SSC,0.5*SSC,0.2*SSC, 0.5M TBS ) 一. 细胞和冰冻切片 准备工作:缓冲液的配备 3%柠檬酸――100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7・H2O)3g,pH2.0 左右. 2*SSC――1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3・2H2O,分子量 294)8.8g. 0.5*SSC――300ml 蒸馏水加 100ml 2*SSC 即可. 0.2*SSC――270ml 蒸馏水加 30ml 2*SSC 即可. 20%甘油――20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可. 0.5 M TBS――1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,TRIS 1.2g 纯乙酸 0.4-0.5ml,pH7.2-7.6. 0.01 M TBS(pH9.0-9.5)配法:1000ml 蒸溜水中加 NaCl 9g, Tris 1.2g 操作程序: 注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入 0.1%的DEPC 处理,以抑制 RNA 酶对 mRNA 的分解作用.此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响. 1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或 APES.切片厚度 10-20μ m. 2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为 37℃和5%的CO2,所用培养基为 Dulbecco 基础培养基.细胞长好后 0.1M PBS(pH7.4)洗2分钟*3 次. 3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为 4%多聚甲醛/0.1 M PBS(pH7.2-7.4) , 含有 1/1000 DEPC.室温固 定20--30 分钟.蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存

2 周以 上. 4.暴露 mRNA 核酸片段:切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加

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网址:www.boster.com.cn BOSTER 在/平/凡/中/创/造/奇/迹BOSTER 滴浓缩型胃蛋白酶,混匀) ,37℃或室温消化 5―120 秒钟.有时也可以不消化.0.5M TBS 洗3次*5 分钟.蒸馏水洗

1 次. 5.预杂交:湿盒的准备――干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度. 按每张切片 20μ ι 加 预杂交液.恒温箱 37-40℃2―4 小时.吸取多余液体,不洗. 6. 杂交――用杂交稀释液 稀释地高辛标记的寡核苷酸探针,浓度一般 0.5-2μ g/ml.按每张切 片加 20μ ι 杂交液.将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后,盖在切片上.恒温箱 37―40℃杂 交过夜. 7. 杂交后洗涤:去掉盖玻片,30―37℃左右水温的 2*SSC 洗涤