PDF《急性早幼粒细胞白血病中常见白血病基因突变的 检测及其临床...》

0 5 》 进行描述.剩余细胞悬液于 -

4 0 ℃保存备用. 基因组 D N A P C R及基因组测序 D N A抽提 取初诊 A P L患者骨髓液, 常规 F i c o l l 淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MN C , 约5*106/L).采用 Q i a g e n L D N A提纯试剂盒抽提总 D N A , 检测吸光度 A

2 6 0n m/ A

2 8 0n m值以确定 D N A的纯 度及浓度, 并以去离子水稀释 D N A样本为

5 0μ g / μ l . P C R扩增 应用 P r i m e r P r e m i e r

5 . 0软件设计包设 ・

2 ・ 中国实验血液学杂志 JE x pH e m a t o l

2 0

1 3 ;

2 1 (

1 ) 计引物, 分别包括 F L T

3 、 N R A S 、 A S X L

1 、 E Z H

2 、 ML L P T D 、I D H

1 、C B L 、J A K

1 、D N MT

3 、c K i t 、N P M1 、 I D H

2 、 R U N X

1 、 J A K

2 ( V

6 1

7 F ) 基因的外显子区域;

其中FLT3包括

1 4 、

1 5和20号外显子, N R A S包括

1 号外显子, J A K 2包括 V

6 1

7 F热点突变, 其余基因所 有外显子均进行了扩增.引物及合成产物的正确 性, 均在 N C B I 网站进行对比分析验证, 引物由上海 生工生物合成( 表1).PCR体系 T i a n g e n L Ma s t e r T a qMi x1

2 . 5μ l , 上、 下游引物各 1μ l , D N A模板

1 . 5μ l ,d d H

2 O9μ l , 共25μ l .P C R反应条件:

9 5 ℃预变性 5m i n ;

然后

9 5 ℃ 变性

3 0s ,

5 7-

6 0 ℃退火

3 0s ,

7 2 ℃延伸

3 0s , 循环

3 5次, 最后

7 2 ℃延伸

1 0m i n , 用2%琼脂糖凝胶电 泳检测 P C R产物, 紫外光自动成像仪成像. 基因扩增产物序列分析 P C R产物纯化后进行正、 反向测序( 由上海裕晶生物科技有限公司协助完 成) , 分析各个基因外显子序列的突变情况. 统计学处理 临床资料统计分析采用 χ

2 检验( 分类变量) 或t检验( 数值变量) , 所有统计学方法均采用 S P S S1

6 .

0 进行. 结果各突变分析结果

8 4例初治 A P L患者中, 有23例 F L T

3 I T D突变阳 性(

2 7 .

4 %, 图1),FLT3I........