编辑: 戴静菡 | 2015-04-06 |
11212 逆转录聚合酶链反应( RT- PCR) :
5 @ Buffer10LL, 10mM dNTP 1L L, 25mM MgSO4 2LL , AMV1LL, TfI1LL , 引物
1 和引物
2 各5LL, RNA5L L, DEPC 水20L L.反应条件为
48 e 45min, 94e 2min;
94 e 30s, 60e 1min, 68e 2min,
40 个循环;
68 e 7min.待反应结束后, 将RT- PCR 产物在 1% 琼脂糖 胶上电泳, 观察结果.
11213 PCR 产物的纯化与目的基因的克隆: 用DNA 回收试 剂盒对PCR 产物切胶回收.DNA 与pGEM- T 载体在T4 连 接酶的作用 下, 4e 连 接过夜.连 接产物 转化入 E1 coli JM109 感受态细胞, 将其涂布于预先铺有 IPTG 和X- gal 的含2@AMP YT 的培养皿上, 37e 倒置, 培养过夜.
11214 重组质粒的鉴定: 经蓝白斑筛选, 挑选白色菌落扩 增培养, 碱裂解法提取重组质粒, 用BamHI 和XholI 酶切鉴 定.
11215 序列测定及分析: 亲肌肉基因重组质粒的序列测定 由大连宝生物公司和上海生工公司进行, 将测序结果在 NCBI/ Genebank 数据库进行 blast 比较和分析.
2 结果 2.
1 目的基因的扩增 RT- PCR 扩增出特异性亲肌肉基 #
185 # 第28卷3期2006 年6月宁夏医学院学报 Journal of Ningxia Medical College 因片段, 大小为 573bp( 图1) . M1200bpDNA Marker
11 亲肌肉基因扩增产物 图1亲肌肉基因 RT- PCR 扩增产物 2.
2 亲肌肉基因/ pGEM- T 重组质粒的构建及鉴定 目的 片段的 PCR 产物与 pGEM- T 载体连接, 构建了重组质粒, 经酶切鉴定, 得到了大小为 573bp 的DNA 片段( 图2) .
1 1 酶切 pGEM- T
21 未切重组质粒
31 双切重组质粒 M11lambdaDNA/Hind?1 M21 200bpDNA Marker 图2亲肌肉基因/ pGEM- T 重组质粒的酶切鉴定
21 3 亲肌肉基因序列的测定及分析 克隆出的亲肌肉基 因经测序 ORF 为573bp, 与GenBank 中已发表的基因( 序列 号: Z29075) 核苷酸序列进行同源性比较为 100% ( 图3) , 推 导编码氨基酸序列同源性为 100% . Query Sbjct &
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