PDF《禽网状 内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能》

2 5 p mo l / L) 各2pL,模板 DNA约20pg,rTa q 2U. P C R 反应程序如下:9

5 ℃

5 mi n后,按95℃

4 5 s ,5

0 ℃

4 5 s ,7

2 ℃

2 mi n进行

2 8个循环;

最后

7 2 ~ C延伸

1 0 mi n . 扩增产物用

0 .

8 %琼脂糖凝胶进行 电泳鉴定 ,对于不同大小的片段程序 作了适当的调 整.1.6重组质粒 的构建

1 .

6 .

1 p UC ― L T R质粒的构建:将LTRPCR产物与 p UC1 8载体分别用 E c o R I 和SacI酶消化 ,经连接 和转化后 ,筛选阳性克隆.获得的阳性质粒与 B G H 终止序列 的PCR产物同时用 S p hI 和SalI双酶切 , 然后按一般方法筛选和鉴定阳性克隆.

1 .

6 .

2 p U C― L T R ― G F P 和pUC ― L T R ― g p

9 0 质粒的构 建 :将 GF P基因的 P CR产物和 p UC ― L T R 质粒用 K p n I 和SalI双酶 消化后,连接和转化.同法,将gp90PCR产物和 p UC ― L T R质粒用 S a l I 和风f I 消化,经连接和转化后,常规方法筛选阳性克隆 .所 有重组质粒均经序列测定验证 .

1 .

7 重组质粒 的转染 用Qi a g e n 公司的质粒制备试剂盒制备puC― L T R,p U C― L T R ― G F P和pUC― L T R ― g p

9 0质粒, 经定量后保存备用.按照 L i p f e c t a m i n e说明书进行 转染 ,取1,2 ,3 ,4 ,5 ,6 p g质粒分别与

8 p L的脂质体共转染长满70%~

8 0 %的CEF瓶皿中(35mm) ,

6 h后,加入等体积的含

1 0 %犊牛血清的 D ME M 培养基继续生长 .

1 .

8 表达产物的检测 对pUC― L T R ― GF P质粒 ,转染24h后 ,将细胞瓶直接置于荧光显微镜下观察 ;

对pUC― L T R ― g p

9 0 质粒,转染

2 4 h ,4

8 h和72h后,分别从瓶皿中取 出一预先放 置的盖玻片 .用一

2 0 ℃预冷 的丙酮 固定

5 mi n .吸取 1:

1 0 0稀释 的鼠抗 g p

9 0( 大肠杆 菌表 达 )血清 ,小心加到固定好的盖玻片上,3

7 ℃作用

4 0 m i n , l x P BS洗涤三遍 ;

加上 F I T C标记 的抗 鼠l u G 荧光抗体 ( 1:

2 5

6 ) ,3

7 ℃作用

4 0 mi n ,1 xP B S洗 涤三遍.加一滴

5 0 %甘油于盖玻片上 ,在荧光显微 镜下观察并拍摄实验结果.

2 结果2.1PCR扩增结果PCR程序经适 当调整后 , 获得 了所有预期大小 的PCR产物 .图 1显示 了不同长度 P C R产物的琼 脂糖凝胶 电泳结果. 维普资讯 http://www.cqvip.com 赵文明, 等.禽网状 内皮组织增殖病病毒 L T R序列的启动子功能

2 .

2 重组质粒 的鉴定 重组 质粒通过 不 同的 限制性 内切酶初 步鉴定 后 ,经序列测定,与发表 的序列完全一 致 .图

2 显示 了pUC― L T R质粒的不 同酶切图 潜. 冈图1PCR产物 电泳 图Fig1TheclectrophotesisfortheproductofPCR

1 . P CR p r D d u c o f g p

9 ~ .

2 P CR p r o d u c t s o fGFP ;

3 , P CR pr o d u c l s o fBGH ∞ PcR p r c , ~ a v . - t z o fL TR;

5 . Ma ........