PDF《酵母双杂交筛选OIPK相互作用蛋白*》

26 Keywords yeast two-hybrid;

Ser/Thr protein kinase;

plant resistance;

oligochitosan;

OIPK CLC Q943.2 摘要前期研究发现烟草中一个壳寡糖诱导的Ser/Thr蛋白激酶(Oligochitosan induced protein kinase, OIPK)在壳寡 糖诱导的烟草抗性反应中起着重要作用. 目前在烟草中发现OIPK基因的两个选择性剪接体: OIPKL和OIPKS, 其中 OIPKL是3个选择性剪接体中序列最长的. 为进一步研究OIPK在壳寡糖诱导植物抗性中起的作用, 本研究采用酵母双 杂交方法, 以pGBKT7-OIPKL为诱饵质粒, 筛选构建在pACT2载体上的烟草cDNA文库, 寻找OIPKL的相互作用蛋白. 结果表明OIPKL蛋白在酵母中可以和烟草的S-腺苷甲硫氨酸合成酶、 泛素激活酶? E1? 、 丙酮酸激酶、过氧化物酶相互作 用. 实验结果为研究壳寡糖诱导抗性机理提供了一定依据. 图3 参26 关键词 酵母双杂交;

Ser/Thr蛋白激酶;

植物抗病性;

壳寡糖;

OIPK CLC Q943.2 收稿日期: 2009-10-16???? 接受日期: 2009-11-02 *国家高技术研究发展计划 (

863 计划) 项目 (Nos. 2006AA10A213,

2 0

0 7A A0

916 01)、 中国科学院知识创新工程 重 要方向项目(N o s . KSCX2-YW-N-007, KSCX2-YW-G-041) 和科技人员服务企业行动项 目(No. 2009GJE20020) 资助 Supported by the High-tech Research and Development Program of China (Nos. 2006AA10A213, 2007AA091601), the Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences (Nos. KSCX2-YW-N-007, KSCX2-YW-G-041) and the Scientists-Company Cooperation Project of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2009GJE20020) **通讯作者 Corresponding author (E-mail: articles1805@gmail.com;

duyg@dicp.ac.cn)

475 4 期 杨金丽等: 酵母双杂交筛选OIPK相互作用蛋白 过酵母双杂交的方法寻找OIPK的结合蛋白以推测其功能, 以期为深入认识和研究OIPK激酶介导的信号通路奠定基础.

1 材料与方法 1.1 实验材料 烟草By2细胞由本实验室培养. 大肠杆菌Top10菌株、 质粒pGBKT

7、pACT

2、pGEX-4T-1-OIPKL、pGBKT7-

53、 pGADT7-T、pGBKT7-Lam由本实验室保存;

PCR产物纯化 试 剂盒 购自上海华 舜生物工 程 有限 公司;

限制性内切酶 BamHⅠ和XhoⅠ、 T4 DNA连接酶购自Takara公司;

DNA分 子量标准购自Fermentas;

引物由生工生物公司合成. SD培 养基、X-α-??? gal购自Clontech公司. 鲑鱼精DNA、玻璃珠、 PEG3350 购自Sigma公司;

由质粒pACT2构建的烟草BY-2细胞 的cDNA文库由Nathalie Glab教授惠赠[20] . 1.2 诱饵蛋白表达载体构建 根据GenBank中的序列EU359698设计引物P1 (5'

AGTG GATCCATATGTACAAGGGACGATTTTC3'

) , P2(5'

GAGCT GCAGTCAATGTCTTCTTGGTTTGT3'

) , 其中P1引物中含有 BamHⅠ酶切位点,P2引物中含有PstⅠ酶切位点及终止密码 子. 以pGEX-4T-1-OIPKL质粒为模板, 用Pfu酶和P

1、P2引物 进行PCR扩增, 电泳后切下PCR条带进行胶回收, 将回收到 的PCR产物和酵母表达载体pGBKT-7分别经BamHⅠ和PstⅠ 双酶切, 回收酶切的PCR片段和载体, 用T4连接酶于16 ℃? 反应1?? h, 转化Top10菌株后, 提取质粒, 进行酶切鉴定和测序. 1.3 酵母细胞的转化 按照Clontech公司酵母双杂交操作手册进行. ........