PDF《pEGFP-N1/TNFR 1 载体的构建及鉴定1》

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paper.edu.cn -1- pEGFP-N1/TNFR

1 载体的构建及鉴定1 叶顺传,曾秋棠,吴辉文,吕云波 华中科技大学同济医学院协和医院心研所,湖北武汉(430022) E-mail:yeshunchuan@gmail.com 摘要: 目的:本研究旨在构建人肿瘤坏死因子受体(TNFR 1)绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP-N1/TNFR 1,为研究 TNFR

1 细胞内转位奠定实验基础.方法:培养 U937 细胞,提取RNA,RT-PCR 扩增出 TNFR

1 cDNA 基因片段,将TNFR

1 基因的 RT-PCR 纯化产物及 质粒 pEGFP-N1 DNA 经Sac I 和Kpn I 双酶切、 胶回收纯化酶切片段后, 体外连接酶切片段, 使其定向重组,再将重组 DNA 转化 E. coli DH5α 感受态细胞,经复苏后,在含 Kanr 的LB 固体培养基上筛选出阳性克隆. 结果: 挑取的 LB 固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定, 证实均为阳性克隆,即TNFR

1 与pEGFP-N1 体外重组成功.结论:采用体外重组技术,成 功地将人 TNFR

1 cDNA 插入了荧光蛋白表达载体 pEGFP-N1 中. 关键词:TNFR 1;

真核表达载体;

质粒 pEGFP-N1;

克隆 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是具有多功能的多肽,在炎症反应中起重 要作用.在介导细胞损伤的过程中,TNF 主要结合并活化 TNF 受体(TNF receptor 1,TNFR 1) ,然后 TNFR

1 激活下游信号通路,这些通路在心肌细胞和血管内皮细胞凋亡起其调节作 用[1] ,但TNFR

1 细胞内转位通路及调节因子尚不明确[2] . 绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein , GFP)是20世纪90年代中期发展起来的一种全 新的报告分子.GFP 分子质量小, 易与其他目的基因形成融合基因, 对细胞无毒副反应, 而 且其化学性质稳定, 使用方便, 可以在活体细胞中定时观察, 所以连接有 GFP 的载体 pEGFP-N1 在分子生物学中被广泛应用. 本研究旨在构建以 GFP 为报告基因的重组表达质粒 pEGFP-N1/TNFR 1, 为下一步转染 人脐静脉血管内皮细胞并观察其表达情况, 进一步研究 TNFR

1 细胞内转位通路及调节因子 奠定基础. 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂: Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司. RT-PCR 试剂盒购自大连宝生物. PCR 产物纯化试剂盒 购自 Promega 公司.质粒抽提试剂盒、DNA marker 购自北京天根生化.T4 DNA 连接酶、 限制性内切酶 Kpn I、Sac I 购自 NEB 公司.国产胎牛血清购自杭州四季青.RPMI

1640 培 养基为 Hyclone 公司产品.引物的合成和序列测定由上海生工完成. 1.2 细胞、质粒与菌株: U937 细胞、质粒 pEGFP-N1 由华中科技大学同济医学院免疫学国家重点实验室惠赠, DH5α 感受态细胞购自天根生化科技(北京) . 1.2 方法 1.2.1 U937 细胞培养

1 本课题得到教育部博士点专项基金资助项目(20040487067)的资助.? http://www.paper.edu.cn -2- 人类白血病细胞 U937 细胞株接种于含有 10% 胎牛血清、 青霉素

100 U/ml 及链霉素

100 U/ml 的RPMI

1640 培养液中,于37℃、5% CO

2、饱和湿度下培养,每2天换液

1 次,视 生长情况进行适当传代. 1.2.2 细胞总 RNA 的提取 培养的 U937 细胞,1000rpm,离心 6min,收集细胞.以Trizol 试剂抽提细胞总 RNA, 紫外分光光度法测定 A260/A280,使用的标本符合 A260/A280 1.8~2.0. 1.2.3 人TNFR

1 基因扩增片段的引物设计及合成 参照 TNFR1 cDNA 的基因序列(GeneBank No. M58286)设计引物 T

1、T2 扩增全长 TNFR 1. 前向引物 T1 在ATG 前加入 kozak 序列以提高转录起始的效率, 并在 5'

端引入 Sac I 酶切位点. 前向引物 T1 为: 5'