编辑: 赵志强 | 2015-04-06 |
%virulent%protein%secretion%system;
%Rv3871;
%pathogenicity;
%bioinformatics % 结核病是一种严重地全球性传染病,已困扰人类 数千年, 其致病菌为结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,%MTB). 近年来,由于耐药性结核杆菌不 断产生以及与人类免疫缺陷症病毒(HIV)的交叉感 染等因素,结核病流行呈现显著上升趋势,极大地威 胁我国人民健康,成为突出地重大公共卫生问题. 因此,阐明结核杆菌致病机制和传播模式具有迫切地现 实意义. 与卡介苗基因组相比,致病性结核分枝杆菌 基因序列有
16 个差异区域,分别命名为 RD1-16. 其中RD1 仅存在于人及牛型分枝杆菌毒力株, 强烈显 示其致病学意义[1-2] . RD1 区基因由Rv3871-% Rv3879c%等9个基因组成,其中部分基因可能参与了 结核杆菌毒力蛋白结构的构型和蛋白复合体的形成 [3] ,并在相关基因编码蛋白的参与下完成蛋白分泌[4] . 可见 Rv3871 在RD1 毒力蛋白分泌系统中发挥着核 2009;
29(12)南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)
2371 ・ ・ 图1%%PCR 扩增的 Rv3871 基因 Fig.1 PCR products of Rv3871 gene M:DNA%marker%(marker%Ⅳ);
1:%PCR%products%of%Rv3871 bp
7500 5500
3500 2000
1000 500 M%1 心作用.为探索 RD1 蛋白分泌系统和 Rv3871 基因的 结构和功能, 本研究对 Rv3871 基因进行分子克隆、 蛋白表达,利用生物信息学方法对该基因及其表达蛋 白的结构和功能进行比较性分析,为结核杆菌致病机 制的阐明提供依据. 1%%材料和方法 1.1%%质粒和菌株 质粒 pET32a (+)、E.coli DH5a、E.coli BL21 菌株 由本实验室常规保存. 1.2%%主要试剂 高保真Taq%DNA 聚合酶及PCR 试剂盒购自Takara 公司;
DNA 限制性核酸内切酶 BamHⅠ、XhoⅠ 及核酸、蛋白分子量标准品购自 Ferments 公司;
DNA% Marker%Ⅳ购自天根生化科技有限公司;
质粒提取试 剂盒、胶回收及PCR 产物纯化试剂盒均购自OMEGA 公司;
IPTG 购自广州展晨生物科技公司. 1.3%%结核分枝杆菌 H37Rv 基因组由本室保存. 1.4%%PCR 引物的设计与合成 根据 Genbank 中Camus[5] 等报道的 Rv3871 基因 序列及质粒 pET32a(+)克隆位点序列设计 PCR 引物. Rv3871 基因上游引物P1:5'
-CGggatccATGACTG% CTGAACCGGAAGT-3'
;
下游引物 P2:5'
-CGctcgagTT% AACCGGCGCTTGGGGGT-3'
;
上游引物和下游引物 5'
端分别引入 BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点(小写部分为 酶切位点)及保护碱基. 引物由上海 Invitrogen 公司 合成. 1.5%%目的基因的 PCR 扩增与纯化 以结核分枝杆菌 H37Rv 株基因组为模板, 反应 体系为:H37Rv%株基因组 DNA%1.0%μl, 超纯水 H2O% 32.5%μl,5*PS%Buffer%10%μl (含Mg2+ ),dNTPs%4.0%μl, P1/P2%1.0%μl,Prime%STAR 高保真Taq%DNA 聚合酶0.5%μl,总反应体积为 50%μl.反应条件:94%℃预变性 4% min,98%℃变性 10%s,59%℃退火 15%s,72%℃延伸 2%min,
30 个循环后,72%℃延伸 7%min.扩增产物以 1%琼脂糖 凝胶电泳检测. 按DNA 胶回收试剂盒说明纯化回收 扩增产物. 1.6%%质粒 DNA 的提取 含有 pET32a(+)质粒的 DH5α 菌液增菌后,采用 OMEGA 公司的质粒提取试剂盒提取质粒,用适量双 蒸水溶解 DNA,经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度 及浓度. 1.7%%重组质粒的构建及鉴定 Rv3871 基因和 pET32a(+)质粒均用 BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶双酶切, 回收酶切产物,用........